不停歇的蛋白质组学分析：全新一代Exploris 240质谱

作者：赛默飞世尔科技 2020-06-09T15:43 (访问量:10688)

不停歇的蛋白质组学分析：全新一代Exploris 240质谱

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引言

赛默飞是蛋白质组学领域的领导者，每一款产品一经推出即成为万众瞩目的焦点。今年的质谱年会上赛默飞重磅推出智能化Exploris系列质谱—— Orbitrap Exploris 240。这款新产品的到来，进一步拓展了赛默飞超高分辨质谱在蛋白质组学领域的产品线，同时也为我们带来全新的蛋白质组学体验。让我们一起领略Orbitrap Exploris 240质谱的丰富多彩的蛋白质组学应用吧。

一． Exploris 240的性能参数和蛋白质组学应用概览

1 Exploris 240的性能特点

Exploris 240是四极杆和超高场Orbitrap的串联质谱，分辨率最高可达240,000，扫描速度高达22Hz，在蛋白质分析的功能上支持APD（Advanced Peak detection）算法；R 45000用于TMT 11plex和TMTpro（16plex）的分析；兼容FAIMS Pro离子淌度接口；支持DDA, DIA, PRM, t-SIM多种扫描模式；通过Biopharma option的扩展m/z 至8000用于完整蛋白分析；Easy IC的实时内标校正模式使质量轴稳定在1ppm。

图1. Orbitrap Exploris 240 MS

产品特点

• 超高场 Orbitrap 分析器

• 质量范围 m/z 40-6000

• 质量精度内标 <1ppm，外标 <3ppm，Easy IC 实时内标校正

• 最高分辨率 > 240,000

• 扫描速度高达 22 Hz

• 扫描模式：FS, t-SIM, DDA TopN, DDA TopTime, DIA, t-MS2 (PRM), AIF

• 高级扫描模式：AcquireX, APD, TMT @ 45k

• 选配：FAIMS Pro，Biopharma option

2 Exploris 240应用于蛋白质组学分析的设计理念

Exploris 240质谱平台上融合了赛默飞在蛋白质组学积累的最先进技术和工作流程，通过打包的方式呈现给用户。Exploris 240可以开展基于DDA的蛋白质鉴定和定量流程，基于DIA的定量流程，TMT的定量流程，基于PRM的靶向蛋白定量流程，这些工作流程都以方法模板的形式内嵌在质谱方法中，操作人员只需要针对特定的实验设计选择对应的方法即可。同时Exploris 240延续了Exploris 480稳定的硬件设计，可以无间断分析临床大队列样本。

图2. Orbitrap Exploris 240 质谱仪-**的性能，多功能性和易用性

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二． Exploris 240蛋白质组学工作流程

1 深度、快速蛋白质组覆盖

赛默飞全球组学应用开发团队对不加FAIMS Pro的4台Exploris 240进行蛋白鉴定数目测试（1μg Hela酶切肽段，60分钟梯度），4台Exploris 240蛋白鉴定数目均在5300个蛋白以上（图3），显示出仪器间具有很好的重现性。

图3. Exploris 240在1 μg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色谱柱，不加FAIMS Pro的情况下肽段和蛋白鉴定数目

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Exploris 240加载了FAIMS Pro 后，蛋白质组的覆盖深度进一步提高，蛋白鉴定数目可提高25%。1小时梯度，1μg Hela酶切肽段中蛋白鉴定数超过了6000个蛋白。

图4. Exploris 240在1 μg Hela酶切肽段, 60 min LC gradient, Top 20 method, ES803色谱柱,不加装FAIMS Pro，FAIMS单电压CV (-45V), FAIMS双电压 (-50/70V)的条件下肽段和蛋白鉴定数目

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接着对不同梯度的200ng Hela进行蛋白鉴定深度测试，30分钟可鉴定3432个蛋白，60分钟可鉴定5064个蛋白，90分钟可鉴定5986个蛋白，120分钟可鉴定6335个蛋白。

图5.Exploris 240在200ng Hela酶切肽段, 不同色谱梯度, Top 20 method，Ionopticks 625px column，FAIMS双电压(-50/70V)的条件下肽段和蛋白鉴定数目

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继续对不同浓度的Hela酶切肽段进行测试，Hela的浓度范围从10ng到1000ng，跨越3个数量级，在每个浓度下Exploris 240均能获得惊人的蛋白鉴定数。即使在10ng低浓度的上样量的情况下，Exploris 240仍然能够鉴定1600个蛋白。

图6. Exploris 240在不同浓度HeLa digest，90min色谱梯度，FAIMS Pro 2 CV (-50/-70)， Ionopticks 625px column， Proteome Discoverer™ 2.4 Mspep谱图库检索，1%FDR的肽段和蛋白鉴定数目

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需要注意的是，FAIMS Pro在多肽分离上具有完全正交性，如图7所示，200ng Hela 30min梯度-50V和-70V鉴定到的肽段中只有3%的肽段是重复鉴定的。

图7. 200ng Hela, 30min梯度CV -50V和-70V的肽段的Overlap图，只有3%肽段重复鉴定

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此外，针对很多蛋白质科学平台老师日常工作中常见的IP蛋白鉴定样品，Exploris 240可以将IP样品分析的时间缩短至30分钟。免疫富集AKT/mTOR通路中12个蛋白的样品在30分钟梯度内就可以鉴定到超过1600个蛋白，大大缩短了分析的周期。

图8. 高通量IP蛋白鉴定。免疫富集 AKT/mTOR通路的12个蛋白，进行蛋白酶切，使用15min和30min梯度蛋白质鉴定

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2 深度、精确蛋白质定量

定量蛋白质组学是蛋白质分析的必备手段，Exploris 240可实现非标记定量（图9），DIA定量，TMT定量（图10）和PRM靶标定量（图11）4种模式，满足定量蛋白质组学分析的多种需求。Exploris 240源于Orbitrap的定量技术，定量性能可达amol级别灵敏度，并实现 5个数量级的线性范围。

图9. Exploris 240非标记定量性能。两种蛋白质混合物的精确非标记定量。酵母蛋白消化液以1:10,1:5,1:2的比例加入到200 ng Pierce HeLa消化液标准品的背景中。在Orbitrap Exploris 240 质谱上对两种蛋白混合物进行分析，然后在Proteome Discoverer™2.4软件中使用Minora feature detector 模块进行LFQ数据处理

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图10. 基于TMT的高准确度定量的可重现性。A) 在带有FAIMS Pro接口的Orbitrap Exploris 240 质谱上使用两种补偿电压(-50和-70 CV)，对500ng TMT 11plex 标记的酵母消化标准品进行60分钟梯度的定量分析。该标准样本为用户提供了一个工具，用于不同仪器测量TMT方法的准确性、精密度和蛋白质组深度的考察。B)所示的是FDR卡值为1%以下的蛋白质和多肽的定量数量。C)所有重复的无干扰指数均达到75%。

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图11. Exploris 240准确的PRM定量性能。Pull-down AKT/mTOR通路的12个蛋白，加入AKT/mTOR SureQuant kit轻标和重标肽段，含有30个高纯度的重标和轻标肽段，进行PRM定量分析。83%肽段CV<10%，可达5个数量级的动态范围。

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3 应用于临床大队列分析

蛋白组大队列分析是很多临床和转化医学实验室的诉求，Exploris 240继承了Exploris 480稳定和易用的硬件设计，真正做到不停歇的蛋白组分析。今年赛默飞精准医学中心开发了快速蛋白质组分析流程，自动化的样品前处理每天可以处理500个样本，高通量的LC-MS分析可以实现60个样品/天的通量。

图12. 大规模临床队列分析实验流程。自动化的样品前处理酶切方法每天可以处理500个样本，1台Exploris 240可以实现60样品/天的分析速度，分析1000个样品只需要18天的机时。同时不同Exploris 240质谱之间数据结果具有高度一致性，实现多台质谱同时分析。

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Exploris 240可以加配FAIMS Pro离子淌度接口，质谱分析中，FAIMS Pro只选择特定的肽段离子进入质谱，阻挡了很多干扰物离子，大大缩短仪器的维护周期，用户只需要定期对FAIMS Pro进行维护即可，而维护FAIMS Pro只需要短短半个小时的时间。赛默飞全球应用开发团队比较了在清洗FAIMS Pro前后，TMT标记的蛋白鉴定数目和IFI指数几乎一致，用户无需担心维护FAIMS Pro会导致实验重现性的差异。

图13. FAIMS Source Pro易于安装和维护，同时支持气相分离，并通过去除污染物提高了仪器的可靠性。在清洗FAIMS Pro前后，蛋白的鉴定数目和共隔离指数一致。

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总结

Exploris 240是赛默飞蛋白质组学领域继Exploris 480之后的又一集大成之作，融合了赛默飞最尖端的蛋白质分析技术，将蛋白质组学的应用方法模板化，方便用户使用；同时在蛋白鉴定数，定量性能上有优异的表现，且充分考虑了大队列蛋白质组分析中仪器稳定性的问题，可以预见Exploris 240必将成为蛋白质组分析不可或缺的主力成员。

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