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SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍

作者：上海基星生物科技有限公司 2008-05-24T00:00 (访问量:8450)

SSH是一项可以快速获取两个不同生物材料中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。该技术尤其适合以genome尚不完全清晰的物种或者以特殊材料为研究对象的科研工作者。是基因芯片技术的有效补充。

基本流程:通过差减文库构建，文库验证和筛选（逆向斑点杂交），获得阳性克隆，对阳性克隆测序及生物信息分析，可判定差异基因的情况。另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列，并可用Northern blot 或Real－Time PCR加以验证。

抑制性消减杂交文库技术

是一种革命性的差异表达基因筛选技术。该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特点。现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基因分型差异的研究。

技术方法成熟有效

不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异基因片段。

放大稀有转录本

本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也就是说，利用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。

仅仅需要500ng的poly A＋ RNA

与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA即可进行有效实验。如果您只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋ RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑制性消减杂交实验。

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