微量样本总RNA提取试剂盒

中文名称：微量样本总RNA提取试剂盒
英文名称：Total RNA Extraction Kit from trace sample
产品规格：50次
本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从多种不同类型的微量样品中快速提取总RNA。本试剂盒特别加入了Carrier RNA，可以从体系中轻松捕获微量核酸,具有方便快捷、产量高、重复性好的特点，30-40分钟内即可完成反应。与其它提取RNA的普通方法相比，微量样品RNA提取试剂盒将所有<200bp的RNA（5.8S rRNA,5S rRNA和tRNAs等）选择性的筛除，而所有>200bp的RNA则被富集、分离和纯化。提取的总RNA纯度极高，没有DNA和蛋白质污染。

产品特点：
·从微量的样本中纯化得到的高质量的RNA，如显微切割得到的组织，纤维组织和细胞。
·配有高效的DNase Ⅰ，可有效去除DNA污染。
· RNA纯度更高，无杂质残留，特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
·操作安全可靠，无需酚/氯仿抽提，无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀。

下游应用：
· RT-PCR。
· Northern Blot、Dot Blot。
· Real-Time PCR。
·芯片分析。
· polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

Carrier RNA的作用：
试剂盒中提供了一种特殊Carrier RNA，当需要从非常少量的样品中提取RNA时，推荐在操作步骤中加入Carrier RNA，这样有助于提高RNA与吸附柱的结合。

试剂盒组成：

储存条件：在室温（15-25℃)条件下运输，收到试剂盒后，请立即将RNase-free DNase I,缓冲液RDD和RNase-free ddH2O置于2-8℃保存，其他试剂可置于室温（15-25℃)保存。

选配试剂：蛋白酶K（目录号：WH0215）；研磨杵（目录号：WH9004）；过滤柱CS：（目录号：RK124）

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇

使用前注意事项：
1．为了防止RNA的降解，请避免未处理的样品在室温长时间放置，在组织固定前，RNA处于无保护状态，所以请将组织在液氮中速冻。
2．组织裂解液（在裂解液RL中）可在-70℃储存数月。处理冻存的裂解液时，可在室温或37℃水浴中将样品完全解冻，而且请注意裂解液中的盐需要完全溶解，之后立即进行后续操作。（长时间37℃处理将会导致RNA的化学降解）。
3．所有步骤在室温进行，为了尽量避免RNA的降解，操作越快越好。
4．在使用前，请用RNase-Free ddH2O配制乙醇溶液。
5．操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RL可在4℃放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
6．第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

表1：微量样品RNA提取试剂盒技术指标

  注意：如果超出该试剂盒的最大吸附能力，RNA的产量可能会降低，而如果样品未能裂解完全，RNA的产量也会降低。

表2：不同培养条件下HeLa细胞的数量

3．样品的储存和处理
组织若不经过处理，其中的RNA处于无保护状态，容易被降解，所以新鲜组织应及时放入液氮中速冻并立即储存于-70℃，冻存的组织不能反复冻融以避免RNA的降解，样品也可以在匀浆后加入裂解液RL，储存于-70℃，冻存的样品可稳定储存数月。
4．样品的裂解和匀质
有效的裂解和匀质是提取RNA的重要步骤，裂解和匀质是两个不同的步骤。
裂解：将组织和细胞完全裂解，以彻底释放出样品中所有的RNA，不同的样品裂解的方法不同，如果样品裂解不彻底，将导致RNA得率低。
匀质：匀质的过程是为了降低细胞裂解后的溶液粘度，将高分子量的基因组DNA和其他物质切断，形成均一的溶液，利于RNA与硅基质膜的结合。如果匀质过程未处理好，将影响RNA与硅基质膜的结合，从而导致RNA提取量低。匀质的方法包括匀浆、涡旋振荡、过滤柱、注射器或枪头吸取等。
5．Carrier RNA：
当处理<10 μg组织或<5000个细胞时，可将试剂盒中提供的Carrier RNA加入裂解液中，实验证明，Carrier RNA的加入将提高RNA的得率，且不会影响后续实验。

相关溶液的配制：

DNase I储存液的配制：请小心打开装有DNase I的玻璃管盖子，以避免造成DNase I的损失，将DNase I干粉（1500U）溶解在550μl RNase-Free水中，轻柔地上下颠倒混匀DNase I溶液，不要涡旋振荡。
如需长时间保存DNase I溶液，请将玻璃瓶中的DNase I溶液进行分装，在-20℃可保存9个月，DNase I溶液融化后可在2-8℃保存6周，溶解后的DNase I溶液不能再次冷冻。

Carrier RNA储存液的配制：在第一次使用Carrier RNA时，将Carrier RNA（310 μg）溶解在1ml RNase-Free ddH2O中，将溶液分装后储存于-20℃，此时该溶液的浓度为310 μg/ml（310ng/μl）；该储存液应避免反复冻融，冻融次数不能超过3次。（当处理的细胞量小于5000个时，请在裂解液中加入Carrier RNA。）

Carrier RNA工作溶液的配制（以配制10次用量为例）：将5 μl Carrier RNA储存溶液加入34 μl裂解液RL中，用移液器混匀，将混匀后的溶液6 μl加入54 μl裂解液RL中，此时Carrier RNA终浓度为4 ng/μl，取5 μl终浓度为4 ng/μl的Carrier RNA加入裂解液中。

操作步骤：

一、从微切割的冷冻样品中提取总RNA
以下的操作步骤适用于从冷冻的微切割动物组织中分离RNA。要从非常微量的样品中提取RNA是一项很有挑战性的工作，同时要注意，固定和处理样品的过程可能会对RNA完整性造成影响。

1．向样品中加入适量的裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%) （加入裂解液RL的体积与微切割仪器容积有关，但不能超过最大体积为（A) 65 μl （B) 300 μl。)
  注意：（A)指的是微切割仪器Leica AS LMD系统可采用的体积，（B)指的是其他微切割系统可使用的裂解液体积，以下出现的（A) （B)与此一致。
2．如果需要，可将样品和裂解液RL转移至一个较大的1.5 ml或2 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）。补充裂解液RL至体积为（A)75 μl （B)350 μl。
  注意：（A) （B)所指的意义同步骤1，当处理的细胞量小于5000个时，向溶液中加入20 ngCarrier RNA（5 μl 4 ng/μl Carrier RNA），Carrier RNA溶液的配制请见第4页溶液配制说明。
3．涡旋振荡30 sec，使样品匀质化。
4．向样品中加入1倍体积（（A)75 μl （B)350 μl）70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
  注意：如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
5．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在RNase-Free的2 ml收集管中，该收集管试剂盒中已经备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
11．重复步骤10。
12．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
13．将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管（试剂盒中已备用）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm （~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。


二、从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA
以下操作步骤适用于从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA。在从福尔马林固定的微切割样品中提取RNA时，主要的影响因素有：样品的新旧程度、固定的过程和样品的储存条件。RNA可能会降解成<300bp的片段，而本试剂盒能有效吸附>200bp的片段，所以如果样品中的RNA高度降解，可能会出现提不出RNA的情况。

1．预先加热水浴至55℃，为第5步中的蛋白酶K（客户自备，目录号：WH0215）消化做准备。
2．向样品中加入适当体积的裂解液RL（使用前请向RL中加入β-巯基乙醇，终浓度1％），加入裂解液RL体积与微切割仪器的容积有关，但不能超过140 μl。
3．如果需要，可以将样品和裂解液RL转移至1.5 ml或2 ml的RNase-Free的离心管中（客户自备）。补充裂解液RL至体积为150 μl。
  注意：当处理的细胞量小于5000时，向溶液中加入20 ng Carrier RNA （5 μl 4 ng/μl Carrier RNA工作液），Carrier RNA工作溶液的配制请见第4页溶液配制说明。
4．向溶液中加入295 μl RNase-Free ddH2O，然后加入5 μl蛋白酶K溶液（浓度20 mg/ml，客户自备)，用移液器混匀，55℃孵育10 min。室温12000rpm （~13400×g)离心3min。
  注意：此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。
5．用移液器将上层溶液（450 μl左右）转移至一个新的RNase-Free离心管中（客户自备）。
  注意：使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。
6．向吸出的上层溶液中加入0.5倍体积的无水乙醇（通常为225 μl），用移液器混匀。
  注意：在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
7．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，此收集管试剂盒已经备有），轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
9．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。
10．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
11．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
12．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
13．重复步骤12。
14．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
15．将吸附柱CR1放入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中（试剂盒中已备有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm（~13400×g )离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

三、从动物组织中提取总RNA
以下操作适用于从大多数动物组织中提取RNA，如果要从纤维组织中提取RNA，请参考后面的相关方法。从动物组织中提取RNA，若要得到高纯度和高产量的RNA，组织的起始量非常重要，本试剂盒提供的吸附柱CR1最大结合能力为45μg，裂解液最多能裂解5mg的组织。有些组织像脾脏、部分脑组织、肺组织和胸腺组织在提取的过程中有可能会形成一些沉淀，但不会影响RNA的提取。推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

1．确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第2步。
2．在裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％)中将组织块切碎和匀浆（请见步骤2a，2b）
  注意：组织块的切碎和匀浆过程可采用下列2a和2b两种方法之一，当处理小于10 μg的组织时，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作溶液（5 μl 4 ng/μl)，Carrier RNA工作溶液的配制请见第4页溶液的配制说明。匀浆不彻底将导致RNA提取量低，还可能导致堵塞吸附柱CR11的现象发生。
2a 使用匀浆器进行匀浆：将称重过的组织块放在一个大小合适的容器中，加入350 μl裂解液RL，立即进行匀浆至均一溶液（通常时间为20-40 sec），继续步骤3。
2b 使用研磨杵（客户自备，目录号：WH9004）进行研磨：在1.5 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）加入350 μl裂解液RL，将组织块迅速从-80℃转入这个离心管中，用研磨杵充分研磨，彻底将组织破碎，注意避免组织冻融。将此溶液移至过滤柱CS（客户自备，定购信息见第1页）上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g )离心2 min，收集滤液，继续步骤3。
3．将匀浆好的样品（2a）或者过滤液（2b）以12000rpm （~13400×g )离心3 min，用移液器仔细将上清液转移到新的1.5 ml RNase-Free离心管中（客户自备）。
4．向上清中加入1倍体积（350 μl)70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
  注意：如果在以上过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在乙醇加入后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
5．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，试剂盒中已备有），轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
11．重复步骤10。
12．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
13．将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管中（试剂盒中已备有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm （~13400×g)离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

四、从纤维组织中提取总RNA
纤维组织，例如骨骼肌、心脏、皮肤中含有大量的收缩蛋白、连接组织和胶原质，只有去除这些蛋白质，才能使RNA的提取顺利进行。所以在从纤维组织中提取总RNA时，引入了蛋白酶K消化这一过程。
采用以下操作，可成功地从心脏、肌肉和皮肤组织中提取RNA，其他富含蛋白质的组织也可采用此方法进行RNA的提取，值得注意的是，在进行蛋白酶K消化过程中的缓冲液不能对RNase进行长期有效的抑制，因而此方法不适用于含有丰富RNase的脾脏和肠组织等RNA的提取。
推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

1．预先加热水浴至55℃，为第5步中的蛋白酶K（客户自备，目录号：WH0215）消化做准备。
2．确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第3步。
3．在裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％）中将组织块匀浆（3a）或者研碎（3b）。
  注意：当处理小于10 μg的组织时，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作液（5 μl 4 ng/μl溶液)，Carrier RNA溶液的配制请见第4页溶液的配制说明。匀浆不彻底会导致RNA提取量低，还可能导致吸附柱CR1堵塞。采用匀浆器或过滤柱进行匀浆，会比采用其他方式匀浆获得更高的RNA得率。
3a 使用匀浆