NMY51 酵母感受态细胞 NMY51 Chemically Competent Cell

产品规格: NMY51 10×100μl 保存条件：- 80℃ PGADT7（control vector） 10ng/μl 10μl 保存条件： 4℃ Carrier DNA 5ug/μl 100 μl 保存条件： -20℃ PEG/LiAc 3.5 ml 保存条件： 4℃ MATahis3200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZade2::(lexAop) 8- ADE2 GAL4 DUALmembrane 系统是 DUALsystems BioTech 公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术， 它利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一 检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。 此系统采用 NMY51 酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株 Transformation marker 为: trp1, leu2-3，报告基因为：HIS3, ADE2 和 lacZ， 第一步通过营养缺陷型报告基因（HIS3, ADE2）进行选择性生长筛选， 进一步通过 LacZ 报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同 启动子的调控，降低假阳性几率。 原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种 蛋白质的 N 端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。 泛素可以人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人为地将泛素 Nub 的 3 位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI 突变为 NubG）。这样与 Cub 的亲合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我结合或 接近的可能性。其次，将 Cub 部分与人工合成的 LexA-VP16 转录激活因子融合成一个融合蛋白 Cub-LexA-VP16。 正常条件下 NubG 不与 Cub 结合，UBPs 也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后， 将要检测的蛋白质分别与 NubG 和 Cub 融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋 白（prey-NubG）。 如果 bait 和 prey 发生相互作用， 就会促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 识别，导 致 LexA-VP16 的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种 Bait 质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为 LEU；三种 Prey 质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为 TRP。High5TM 系列 NMY51 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经 PGADT7 质粒检测转化效率>10 4cfu/μg DNA 。 1. 取 1 管感受态细胞置冰上融化，6 000 rpm 离心 1min，去掉上清。 2. 加入 320 μl LiTE/PEG 溶液，重悬细胞，然后加入 10μl Carrier DNA(95-100 度 5min 快速冰浴， 重复一次)，预冷目的质粒 2-5ug,体积不多于 20ul（对酵母双杂交实验而言加入 10 μl pGADT7 质粒（约 1 μg），10 μl pGBKT7 质粒（约 1 μg））。 3. 充分混匀，于 30 度 250 rpm 转速下培养 30 min。 4. 42 度热激 2.5min。 5. 6000 rpm 离心 1min，去掉上清。 6. 加入 1 ml TE 溶液，温和重悬细胞。 7. 6000 rpm 离心 1min，去掉上清。 8. 加入 100 μl TE 溶液，重悬细胞，将细胞涂布于相应的营养缺陷型固体合成培养基（对酵母双杂交实验而言为 Trp 和 Leu 双营养缺陷型合成培养基）。 9. 30 度倒置培养 48-96h，直至形成大小合适的酵母菌落。1. 感受态细胞最好在冰上融化。 2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。 3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。 4. NMY51 酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为 27-30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈指数下 降。 5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板 为例：涂 YPDA 平板 29℃，48h 培养可见直径 1mm 克隆；涂 SD 单缺平板 29℃，48-60h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 双缺平板 29℃，60-80h 培养可见直径 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80-90h 培养可见直径 1mm 克隆。