骨髓间充质干细胞BMSCs培养/诱导分化/成骨成脂诱导

骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养

实验动物

4 周龄SD大鼠

主要试剂及仪器

DMEM/ F12培养基、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibico 公司，CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司。

步骤

a． 取SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

b． 碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍。

c． 从中折断骨头，用2ml无菌注射器吸取PBS溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清。

d． 用含10%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12 重悬细胞，接种于无菌培养瓶，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

e． 24小时后弃去培养液，PBS冲洗 2~ 3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每2~ 3d换液1次，7~ 10d细胞生长融合，经0.25%胰酶消化，1~2传代，其后一般3d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

鉴定

胰酶消化P3代细胞，PBS洗涤2次，分别加入PE标记CD29、CD34、CD45、CD90单克隆荧光抗体，并设同型对照，室温避光孵育，应用流式细胞仪检测BMSCs的表面标志。

细胞形态

BMSCs原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态，10~14天70% ~80 %可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。

骨髓间充质干细胞诱导分化

（1）收集细胞：在显微镜下观察培养瓶贴壁面至70%-80%融合，在超净工作台上操作，先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，50mL培养瓶加入胰酶消化液约1-3mL，按此比例进行消化，晃动使消化液铺均匀，置37度培养箱约2-5min，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3mL完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，1 000 rpm离心5 min弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液。

（2）细胞接种：将上述细胞悬液接种于无菌的6孔细胞培养板，加入2mL完全培养基，放入CO2培养箱 37℃培养 。

（3）细胞诱导：待细胞至50%-60%融合时，加入含50ug/lVEGF、10ug/lFGF、10%FBS的诱导培养液，放入CO2培养箱 37℃培养，连续诱导培养21d,每隔2天换液，每周传代1次。

血管形成实验

(1) 将Matrigel放于4℃融化（不能放于室温，凝固之 后不可以再用）。灭菌的100μL枪头，24孔板冷藏备用；

(2) 开始实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和24孔板，在24孔板每个孔中加入150μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置，Matrigel一直保持放在冰上；

(3) 加入胶后，将整个培养板放入培养箱中，放置30min使凝胶凝固；

(4) 取经不同浓度药物A处理的不同代次的主动脉内皮细胞，消化后用无血清的培养基调整细胞浓度到2×105 cell/mL；

(5) 从培养箱中取出24孔板，每孔加入200μL细胞悬液；

(6) 盖上盖子后放入培养箱培养；

(7) 24h内记录细胞变化。

人间充质干细胞hMSC成骨诱导

待细胞长至基本融合后，制备完成的成骨诱导培养液（基础培养液+0.1μmol/L地塞米松+ 50μg/mL抗坏血酸+ 10 mmol/L β - 甘油磷酸钠），每隔一天换液一次，诱导21天后再进行矿化结节的茜素红染色。

茜素红染色： 

1、诱导后细胞爬片用PBS漂洗2x2min；

2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；

3、PBS漂洗，3x2min；

4、茜素红染液染30min；

5、双蒸水冲洗2次；

6、干燥，封片。

3T3-L1脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞

3T3-L1细胞融合至约70%时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至6孔培养板中，待细胞接触抑制2d后(诱导分化第0d) ，用经典激素鸡尾酒诱导方案诱导前脂肪细胞分化，加入分化诱导培养基1（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX、10ug/mL INS），72h后撤去IBMX和DEX，完全培养基中仅含有INS（诱导培养2），继续培养3d后，仅含有10% FBS，2d换液1次，诱导分化8~10d。

注意事项：

1) 待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。太早，细胞没有退出生长周期。太迟，细胞诱导后容易漂浮。 

2) 3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。将细胞冻存起来，使用时再复苏。 

3) 大约需要8~10天，可以诱导分化成功。之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。

细胞细胞形态学观察

倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，胞浆内无脂滴，分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形，胞浆内含有大量的脂滴。

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