免疫组化

免疫组化染色实验原理及步骤

实验原理  抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

免疫组化染色实验步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗；

2. 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

3. 阻断内源性过氧化物酶：切片放入0.3%甲醇过氧化氢溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

4. BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6.  加生物素二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加生物素偶联的二抗，覆盖组织，室温孵育 50min；

7. 加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，覆盖组织，室温孵育 50min；之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；

8.  DAB 显色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色， 自来水冲洗切片终止显色；

9.  复染细胞核：Harris 苏木素复染 3min 左右，自来水洗，分化液分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝；

10.  脱水封片：将切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

11.  显微镜镜检，图像采集分析。

三、染色结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的阳性表达为棕黄色。

免疫荧光

免疫荧光染色实验原理及步骤

实验原理   免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

免疫荧光染色实验步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-无水乙醇Ⅰ 6min-无水乙醇Ⅱ 6min-95%酒精  6min-85%酒精 6min-75%酒精  5min-流水冲洗；

2. 抗原修复：组织切片置于盛有柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

3. 灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min，PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

4. BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6. 加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的荧光二抗，覆盖组织，室温孵育120min。之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；

7.  DAPI染核：滴加 DAPI，室温孵育10min，之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

8. 封片：抗荧光淬灭剂封片；

9. 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。

染色结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

多重免疫荧光

多重荧光染色实验原理及步骤

实验原理   酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法或者抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

免疫荧光染色实验步骤：

1. 复温，水洗：将切片从-20℃拿出来复温30min，蒸馏水洗两次，每次8min；

2. 固定：将切片至于4%的多聚甲醛中固定15min，用PBS洗3次，每次5min；

3. 通透：滴加0.3%Triton-X100破膜液通透20min，用PBS洗3次，每次5min；

4. 阻断内源性过氧化氢酶：切片入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，用PBS洗3次，每次5min；

5. 封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走）,在圈内滴加5%BSA，室温封闭1h；

6. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

7. 复温：湿盒从4℃拿出来复温1h，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

8. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的HRP二抗，覆盖组织，室温避光孵育50min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

9. TSA荧光染料反应液反应FITC（TYR-488）：切片滴加TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织反应10min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

10. 抗体洗脱：将切片置于抗体洗脱液中洗脱15min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

11. 加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

12. 复温：湿盒从4℃拿出来复温1h，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

13. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的HRP二抗，覆盖组织，室温避光孵育50min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

14. TSA荧光染料反应液反应cy3（TYR-555）：切片滴加TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织反应10min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

15. 抗体洗脱：将切片置于抗体洗脱液中洗脱15min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min

16. 加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

17. 复温：湿盒从4℃拿出来复温1h，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

18. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的HRP二抗，覆盖组织，室温避光孵育50min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

19. TSA荧光染料反应液反应594（TYR-594）：切片滴加TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织反应10min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

20. 抗体洗脱：将切片置于抗体洗脱液中洗脱15min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min

21. 加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

22. 复温：湿盒从4℃拿出来复温1h，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

23. 加HRP二抗：切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的HRP二抗，覆盖组织，室温避光孵育50min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

24. TSA荧光染料反应液反应cy5（TYR-647）：切片滴加TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织反应10min，将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；

25. DAPI染核：将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min；滴加DAPI,室温避光孵育10min，之后将玻片置于PBS（PH7.4）在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次6min；

26. 封片：抗荧光淬灭剂封片；

27. 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像，（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光. 647荧光激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。 594激发波长594nm，发射波长615nm. 我们设定为紫红色。）。