细胞基因敲除（敲入）全套服务

预实验：

1.       Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

2.       药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

3.       单克隆培养情况：观察细胞是否可以单克隆培养。

基因敲除（敲入）：

1.       靶点设计

一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.       载体构建和病毒包装

根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体，吉满生物现拥有3类载体：普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体。

3.       内源活性筛选

转染细胞或感染细胞48H后，使用Puro或Blasticidin筛选48H,提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性。将有效的突变型PCR产物测序验证。

4.       Donor载体(基因敲入)

根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体。共转染/感染 Cas9-gRNA和Donor.

5.       单克隆筛选

无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。细胞长好够，验证内源活性并送测。

6.       获得突变型

如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。

相关产品链接：

CRISPR/Cas9基因敲除试剂盒

Cas9质粒构建

Cas9腺病毒服务

Cas9慢病毒服务