一、无损伤钙离子探针“GCaMP-X”

        北京航天航空大学刘晓冬课题组独家授权！欢迎咨询！

GCaMP-X优势：
1. 精准、特异且安全无损；
2. 特别适合超长时程（≥4周）钙信号的监测。

测试结果：
测试病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m-XC，滴度：1.0x10^12，血清型：2/9；
对照病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m，滴度：1.2x10^12，血清型：2/9；
注射区域：在同一只小鼠左脑皮层区域注射GCaMP6m，右脑皮层区域注射GCaMP6m-XC；
注射量：各100 nl。

图一：同一只小鼠左右脑皮层分别注射GCaMP6m和GCaMP6m-X_C病毒，表达3周时长，左脑皮层神经元出现GCaMP6m显著进核现象，而右脑皮层神经元GCaMP6m-X_C无进核现象。


                                                图一、 病毒注射3周后表达状态对比（刘晓冬课题组提供）

图二：步骤同上，表达13周时长，左脑皮层神经元GCaMP6m显著进核，而右脑皮层神经元GCaMP6m-XC依然无进核现象。

                                                                           图二、 病毒注射13周后表达状态对比（刘晓冬课题组提供）

注意：低滴度GCaMP6m-XC表达量相对较低，可能会不利于在体双光子实验，推荐使用者使用10^13高滴度病毒，可有效提高表达量，有利于在体双光子实验。

二、相关原理：
     许多重要的生物学过程如增殖、转录、代谢、胞吐、收缩和凋亡等都有Ca2+的参与，因此，人们付出了巨大的努力来开发和改进分子工具来监测和量化细胞Ca2+的时空动态。利用基因编码钙离子指示剂(GECIs)进行荧光成像，在细胞群、单个细胞或亚细胞水平上检测Ca2+取得了快速进展。钙离子成像技术是利用可以感应Ca2+浓度的钙离子指示剂，检测的是细胞或组织中Ca2+的浓度变化，将钙浓度变化转化为荧光信号，从而使细胞电活动转化为可记录的光信号。钙离子指示剂分为两种，一种为化学指示剂，另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂，例如GCaMP。GCaMP由绿色荧光蛋白（green fluorescent protein , GFP）、钙调蛋白（calmodulin, CaM）和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当有Ca2+结合CaM时，CaM发生构象变化，其轻链区可以结合M13，致使GFP在特定波长的光照下其发色团的质子化作用增强，吸光度增加从而使GFP发出强烈的荧光。

                  GCaMP的结构及作用示意图（来源于维基百科）

         然而，据报道GCaMP在多个方面造成了意想不到的“副作用”，主要是GCaMP引起的细胞损伤。GCaMP可能损害细胞和组织的整体健康，例如GCaMP2转基因小鼠心脏的心肌肥大【1-2】，以及神经元的细胞毒性或死亡【3-4】；在GCaMP5转基因小鼠的海马神经元中观察到放电频率的增加【5】。这些副作用似乎与GCaMP在细胞核内的异常堆积密切相关，通常伴随着神经元内Ca2+动力学的衰减【3-4, 6】。

          2018年4月17日，北京航空航天大学生物医学工程高精尖创新中心刘晓冬研究组在《Nature Communications》在线发表了题为“Improved Calcium Sensor GCaMP-X Overcomes the Calcium Channel Perturbations Induced by the Calmodulin in GCaMP”的论文。该研究首次揭示了含有CaM的GCaMP干扰了L型钙通道(CaV1)的门控和信号传导，破坏Ca2+动力学和基因表达，并通过GCaMP氮端引入能够特异结合apoCaM的保护元件，设计出了新一代无损伤钙离子探针——GCaMP-X，有效地保护了依赖于CaV1的兴奋-转录耦合免受干扰，同时仍表现出部分GCaMP的优良Ca2+感应特性。

GCaMP干扰神经元L型电压门控钙通道（CaV1.3）

       CaV1.3是神经元表达的CaV1通道的一个主要亚型，与细胞核内的转录信号紧密耦合。作者发现，GCaMP能与CaV1.3结合，导致CaV1.3的门控显著增强，钙离子内流增加（图1）。

                                                   图1. GCaMP干扰神经元L型电压门控钙通道（CaV1.3）                        
 
GCaMP导致神经元退化和凋亡

作者还发现，GCaMP也会干扰CaM正常情况下响应CaV1.3钙信号的核迁移过程，长时程表达时引发GCaMP异常核聚集。入核GCaMP扰乱了转录因子CREB信号通路的正常运转，导致神经元退化和凋亡（图2）。

                                                          图2. GCaMP导致神经元退化和凋

GCaMP-X避免了对钙通道门控的干扰
                                                                          
        作者在GCaMP氮端引入了特异性apoCaM保护元件，合成了新一代钙离子探针——GCaMP-X。GCaMP-X有效地解决了有害核积累、急性和慢性Ca2+失调、转录信号异常和细胞形态异常等问题，同时仍表现出GCaMP的优良Ca2+感应特性（图3）。


                                                                图3. GCaMP-X避免了对钙通道门控的干扰

GCaMP-X在长时程的钙离子监测中更有优势

        作者用电穿孔法在机械敏感的外毛发细胞中转染GCaMP6m或GCaMP6m-XC，在短时间的细胞培养中（1天，DIV1），GCaMP6m-XC与GCaMP6m在监测Ca2+信号时无明显差异。而在较长时间的细胞培养( 3天，DIV3)中，GCaMP6m的副作用(例如干扰外毛发细胞中的CaV1.3)将出现。将100、300或500 ms的射流脉冲施加到细胞上，与表达GCaMP6m-XC的细胞相比，GCaMP6m表现为较弱的Ca2+信号反应，引起了Ca2+信号的衰减，而GCaMP6m-XC避免了这个问题（图4）。

                                         

                                                             图4. GCaMP6m-Xc与GCaMP6m的钙离子监测比较

    作者进一步在GCaMP碳端加入定位序列，如：检测近膜钙信号的GCaMP-X_M探针，以及特异性定位于细胞核的GCaMP-X_N探针，以实现监测胞质、膜下和核钙信号，满足不同实验研究的需要。新一代无损伤探针GCaMP-X有效地解决了传统GCaMP探针的弊端，能够安全无损、长时程、精准、特异、多细胞器的定量钙信号监测。这项研究也对未来基于CaM的分子工具的设计有指导意义。

           刘晓冬课题组致力于如下几个方面的研究：1）电压门控钙通道CaV门控-信号耦联（如兴奋-转录耦联）机制及调控；2）基于新型钙探针GCaMP-X的长时程、亚细胞钙信号定量监控；3）感觉刺激响应型钙通道TRP的结构-功能研究；4）重要钙通道的病生理关联。此论文是该实验室继前期工作（《自然》Nature 2010；《细胞•报告》 Cell Reports 2015；《e生命》eLife 2017；及《自然•通讯》 Nature Communications 2018等）的最新研究进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所等方面的支持。
                                     
三、枢密科技GCaMP-X产品列表：