产品内容：

    试剂一：液体×1瓶，室温保存。

    试剂二：液体×1瓶，-20℃保存。

    试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

产品说明：

    TPX属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与GPX类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

    TPX催化H₂O₂氧化二硫苏糖醇（DTT），H₂O₂的吸收波长为240nm，通过测定240nm吸光度的下降速率，通过对照减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的H₂O₂，即可计算出TPX活性。因此本试剂盒可以同时测定样品TPX和CAT活性。

自备仪器和用品：

    紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3 s，间隔7s，总时间3min），然后8000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

二、TPX测定操作：

1. 分光光度计预热30 min后，调节波长到240 nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一和试剂二在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴预热30min。

3. CAT活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂一，80μL试剂三，迅速混匀后于240 nm测定10 s和130s吸光度，记为A1和A2。

4. 总活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂二，80μL试剂三，迅速混匀后于240 nm测定10 s和130s吸光度，记为A3和A4。

注意：每个样品都需要做对照管，以减去过氧化氢酶（CAT）催化降解的H₂O₂。

三、TPX活性计算：

（1）按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol H₂O₂降解为一个酶活力单位。

CAT活性（nmol/min/mg prot）=(A1-A2) ÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T

                           =573×(A1-A2) ÷Cpr

总活性（nmol/min/mg prot）=(A3-A4) ÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T

                         =573×(A3-A4) ÷Cpr

TPX活性（nmol/min/mg prot）=总活性-CAT活性

（2）按样本质量计算

活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol H₂O₂降解为一个酶活力单位。

CAT活性（nmol/min/g）=(A1-A2) ÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

                     =573×(A1-A2) ÷W

总活性（nmol/min/g）=(A3-A4) ÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T

                   =573×(A3-A4) ÷W

TPX活性（nmol/min/g）=总活性-CAT活性

（3）按细胞数量计算

活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每10⁴ 个细胞每分钟催化1nmol H₂O₂降解为一个酶活力单位。

CAT活性（nmol/min/10⁴ cell）=(A1-A2) ÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

                     =573×(A1-A2) ÷细胞数量

总活性（nmol/min/10⁴ cell）=(A3-A4) ÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

                   =573×(A3-A4) ÷细胞数量

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