正常细胞中的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的内侧,在细胞发生凋亡时PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面即暴露在细胞的外环境中。Annexin-V是一种分子量在35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与PS有极高高亲和力可以与之发生特异性结合,将Annexin-V进行荧光素(FITC)标记成Annexin-V-FITC探针,用该探针标记待检测细胞,利用流式仪通过检测FITC信号即可反应带警车细胞的凋亡情况。

当然对于现有的凋亡检测试剂并没有满足于整体凋亡情况的反映,一般的试剂会结合碘化丙啶(propidine iodide, PI)进行更细层面的检测。PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞细胞膜一般会发生破裂,此时PI能够细胞膜进入到细胞核内,嵌入到DNA中,使细胞核释放红色荧光。

在操作过程中,不论是分离组织细胞或是收集培养中的细胞,需尽量避免污染,一般收集1×106的细胞制备成1mL的细胞悬液按照凋亡检测试剂盒说明书进行操作即可,但一定要注意整个过程需要轻柔操作,以免造成细胞是写损伤而影响检测结果。探针孵育完成后需在1小时以内完成检测,另外上机检测时记得配上不做任何标记的阴性对照管哦。

对于实验结果首先我们需要在细胞自身光散射特性方面进行评判。凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前向散射光与细胞的大小有关,而侧向散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前向散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧向散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前向散射光增大;侧向散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前向散射光和侧向散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧向散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此我们必须要进行凋亡因子的直接反映。

前面我们提到凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于其细胞膜损伤,PI能够穿透细胞膜而嵌入DNA中,是细胞核产生红色荧光。而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对于细胞活性鉴定的染料PI有抗染性,则不会有红色荧光产生,正常活细胞与之相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,所呈现的结果即为:左上象限显示机械损伤细胞,为(FITC-/PI+);左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞或晚期凋亡细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为早期凋亡细胞,呈现(FITC+/PI-)。

最后提醒一下想要做流式凋亡检测结果统计的科研汪们,由于用流式检测凋亡时,PI受时间的影响很大,因为标记了PI后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致PI的染色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显加大。根据以前做流式凋亡时的经验,建议每组实验一次可以先做三个复孔,上机前5分钟加PI,最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后,每组实验一次可以做6~8个复孔,然后做统计学分析。严格说来,当做出统计学差异时,这样的实验还要重复三次。但是因检测凋亡时,受细胞状态,PI染色时间,流式检测时间,以及每次实验时的误差等的影响外,很难保证能够完全重复出上次的结果,甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下,每次重复的差异也会出现加大的情况。这时可以适当重复2~3次,尽量使差异减小。

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