一、目标基因调取或合成：

1.根据客户指定序列设计引物或合成全基因。 2.将PCR产物克隆到T载体上，测序验证。

交付内容：携带目的基因的载体10μg，含该载体的DH5α甘油菌株1ml及测序报告。

时间：2-3周

二、目标基因亚克隆：

1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。 2.将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。 3.测序验证构建质粒的准确性。 4.可免费提供表达载体：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC。

交付内容：正确构建的重组表达质粒10μg，含重组质粒的DH5α菌株1ml及测序报告。

时间：2-3周

三、P.pastoris表达菌株电转化：

1.酶切线性化表达质粒。 2.将表达质粒通过电转化到高效的P.pastoris表达菌株中。 3.通过PCR鉴定至少6个阳性克隆。 4.可免费提供表达菌株：GS115，KM71H。

交付内容：PCR阳性克隆甘油菌1ml及PCR结果报告

时间：2周

四、P.pastoris 表达菌株筛选：

1.将6个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白。 2.SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。 3.如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍再作SDS-PAGE检测。 4.需要通过Western-blot方法检测目标蛋白表达的（客户需要提供相关抗体），费用另计。

交付内容：至少1株阳性表达菌株（甘油菌1ml）及表达筛选结果报告。

时间：2周（如果不表达，可再鉴定两批，6个/批共12个阳性克隆，时间相应延长）

五、P.pastoris表达菌株表达优化：

1.对表达菌株进行常规表达筛选，确定表达最优的菌株。 2.对最优的表达菌株，进行优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。

交付内容：最优表达菌株（甘油菌1ml）及优化表达条件结果报告。

时间：2-3周

六、目标蛋白表达及纯化：

1.摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白。 2.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。 3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。 4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

交付内容：纯化好的目标蛋白1-10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签或切除纯化标签的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。

时间：2-3周

说明：

1.如果经过多次实验验证由于基因特殊性目的蛋白确实不表达，向客户交付构建好的表达载体，并收取表达载体构建、诱导表达成本费，并终止后续实验；

2.如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。 

3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少5mg，最多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。

4. 我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。

5. 每次Western-blot检测最多8个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。客户需要提供一抗。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。

说明：

七、目标蛋白的再加工及详细检测：

1：复性研究：利用多种不同复性缓冲液的体系，对目标蛋白进行小量复性试验提供复性后样品供客户检测，可根据客户要求，按照其中一种样品的复性条件制备小量的复性蛋白。

2：除内毒素，

3：过滤除菌，

4：冻干，

交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。

时间：2-3周

八、大规模制备：

按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。

交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。

时间：协商