AH109酵母感受态细胞

保存条件：-80℃。

1.产品简介：

AH109菌株来源于PJ69-2A酵母菌株，将lacZ报告基因引入PJ69- 2A诞生了AH109，此菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1， leu2，报告基因为: lacZ,HIS3，ADE2，MEL1。 AH109 -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768^ 881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey) 的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~ 174位氨基酸 区段的DNA结合域(DNA-BD) 和位于C端768^ 881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4- responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait -BD) 和prey融合蛋白(prey-AD) ，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。AH109有 四个报告基因: lacZ, HIS3， ADE2， MEL1， 分别由三种不同的启动子(GAL1，GAL2， MEL1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。AngYuBio Hi gh5TM系列AH109感受态细胞经特殊工艺制作，经PGADT7质 粒检测转化效率>10⁴cfu/ug DNA。

基因型：MATa，trp1-901， leu2- 3，112，ura3-52， his3-200，gal4 △,gal80△,LYS2 : :GAL1UAS- -GAL1TATA-HIS3，MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3: : MELIUAS-MEL1TATA-lacZ

2.使用说明：

1).取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的目的质粒1-3μg, .Carrier DNA 10μl(95-100℃ 5min快速冰浴，重复一次)，100μl冰.上融化的AH109感受态细胞，PEG/LiAc 500ul， 轻轻翻转混匀6-8次;

2).30℃ 水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次;

3).每支加入20ul的二甲基亚砜; (用于提高转化效率，可不做)

4).42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6- 8次;

5).12000rpm瞬时离心弃上清,每支加入1m1的YPD Plus于30℃复苏1h; (用于提高转化效率， 可不做)

6).12000rpm瞬时离心弃上清，用100ul 0.9% NaCl 重悬，涂板,30℃培养48 - 96h。

3.注意事项：

1).感受态细胞最好在冰上融化, PEG溶液在低温环境下会析出，请于常温下完全溶解后使用。

2).转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3).同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4).AHA109酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃;高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5).菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合 成途径受阻;又由于其.ADE4,5, 6, 7, 8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylaminomidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6).酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例:涂YPDA平 板29℃，48h培养可见直径1mm克隆;涂SD单缺平板29℃，48- 60h培养可见直径lmm克隆，涂SD双缺平板29℃，60- 80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培 养可见直径lmm克隆。

*本试剂仅供实验室研究使用