逆转录PCR RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 １．mode逆转录PCR 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2．实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′－3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。 real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” 3．RT-PCR技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mRNA引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核苷酸 RNase：RNA水解酶 PCR Buffer：RT-PCR缓冲液 MgCl2：2价镁离子 ４．PCR各步骤的目的 预变性 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 三种循环 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 延伸时间原因 用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。 PCR引物的选择 对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。 （1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。 （2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。 （3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3‘末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。 注意事项 (1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。 (2) 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。 （3）PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。