Lip2000转染试剂

Lip2000是一种阳离子脂质体，独特的配方使其在转染DNA或RNA到真核细胞时有以下优点：

l  对多数细胞具有很高的转染率。

l  可直接加入培养基，血清不影响转染。

l 转染后不必立即除去转染剂，可在4～6小时后除去。

注意事项：

l  用Reduced Serum Medium 稀释Lip 2000 和核酸.

l  在培养基中不要加入抗生素，以免细胞死亡。

l  实验之间保持相同的生长条件。

l  测试无血清培养基与Lip 2000的相容性，有的无血清培养基抑制阳离子脂质体的转染。

操作流程：

     转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

     对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。

     对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIP2000试剂。Lip2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。） 注意：即使Lipo 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lip 2000的稀释液，必须在5分       钟内同稀释的DNA混合。

    混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lip2000（第3步）。在室温保温20分钟。 
    注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

    直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
    注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。

    在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

    在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

    对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使     得Lip2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。

l   用量: 24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lip2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染。

l   注意事项:  1) Lip2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。2) Lip2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。3)复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lip2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用Lip2000。4)还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。5)阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。6)注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌。7)应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。