一代测序（3730XL）平台

简介

DNA测序是重要的分子生物学分析方法之一，它不仅为基因表达、基因调控等生物学基础研究提供重要数据，而且也在疾病诊断、基因治疗等应用研究中起着重要的作用。佰真生物拥有多台国际先进的DNA测序设备Applied Biosystems 3730XL测序仪,可提供高质量的基因测序、片段分析，以及基因突变、多态性分析和基因克隆等配套服务，可以满足客户的不同需求。

图2-4. Applied Biosystems 3730XL测序仪

检测原理

双脱氧链终止法，又称为Sanger法，基本原理如下：DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）存在下进行复制，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddN-TP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。

Applied Biosystems 3730XL测序仪以Sanger法为基础，并用荧光标记代替了同位素标记，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性，是基于毛细管电泳和荧光标记技术的新一代DNA测序仪。测序反应产物加入测序仪后，两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正极泳动，并相互分离，依次通过检测窗口。由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在此激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段。DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光。这种代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像，经计算机软件分析后显示测序结果。整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合。经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来。

技术特点

(1) 自动化操作。

(2) 快速电泳，3小时左右即可达到测序要求。

(3) 新型液体分离胶使读序长度达1100bp，精确读序达800bp。

(4) 新型碱基识别与质量评分软件提高了测序准确性。

(5) 电泳温度可达70℃，有助于去除二级结构的影响。

(6) 高灵敏度提高了测序模板DNA的浓度适应范围。

(7) 良好的温控装置保证了片段分析准确性及重现性。

(8) 毛细管内荧光检测，灵敏度高。

(9) 双光束双侧激光激发，荧光信号强度高度均一。

应用领域

(1) DNA常规测序提供多种样品类型的测序服务，包括菌(菌液、穿刺菌、平板)、质粒和PCR产物(原液、已纯化)。根据不同样品和客户需求，还可以提供：

A. 质粒提取。

B. PCR过膜纯化。

C. PCR切胶纯化。

D. 菌液活化。

E. 单个样品的克隆测序。

F. PCR扩增等常规分子生物学实验。

G. 长片段walking测序后的序列拼接等生物信息学分析的服务。

(2) 重测序

A. 引物设计与合成：针对客户感兴趣的DNA区域，可以为客户提供包括PCR扩增引物和测序引物在内所有引物的设计与合成。

B. PCR服务：包括PCR扩增和产物纯化。

C. 测序服务：采用ABI 3730XL测序仪进行重测序反应。整个测序反应和上机过程，均由专业的人员严格按照操作流程完成。

D. 数据分析服务：对整个重测序实验的结果进行初步分析。

样品要求

(1) PCR原液

A. 片段通常大于200bp。

B. 提供浓度大于100ng/μl，体积大于20μl。

C. 2μl电泳检测条带清晰，有主带。

(2) 已纯化PCR产物

A. PCR产物溶于超纯水中。

B. 浓度大于20ng/μl，体积大于10μl。

C. 电泳检测条带单一。

(3) 质粒要求

A. 质粒浓度大于50ng/μl，体积大于10μl。

B. 建议使用相关试剂盒提取。

C. 大质粒需要注明载体长度。

(4) 菌液模板要求

A. 需说明载体的抗性，我们主要提供Amp、Kan、Chl、Tet四种抗生素。

B. 对于低拷贝质粒建议直接提供500ng以上纯化质粒。

C. 提供200μl-1ml左右的过夜培养菌液，离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏。

D. 建议尽量提供穿刺培养的菌种，或用新鲜的菌装到冰盒里运输。

(5) 引物要求

A. 浓度大于3.2μmol/l，体积大于10μl。

B. 随机引物和兼并引物不适合测序。