腺病毒包装技术服务

百恩维生物（Biowit）的腺病毒为血清5型腺病毒，缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区。E1是腺病毒复制所必须的，E1的缺失使其不能自身复制，只能依靠包装细胞如HEK293细胞提供的反式互补进行复制扩增，以此保证腺病毒的安全性。E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统，E3区的去除能减少宿主的体内免疫反应。

Biowit的腺病毒（Adenovirus，AdV）包装通常采用的是最新的AdMAX系统，通过Cre-loxp重组酶，使共转染到HEK293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒，获得的病毒滴度更高。

同时Biowit生物也拥有AdEasyTM腺病毒包装系统，可供客户选择。

Biowit腺病毒包装技术特点：  

（1） 采用5型E1/E3缺陷型腺病毒，生物安全性更高；

（2） 最新的AdMAX系统，病毒生产更快捷；同时也有AdEasyTM系统可供选择。

（3） 有多种过表达和shRNA腺病毒穿梭载体；

（4） 可带有荧光标记基因（GFP、RFP、YFP等），有多种启动子可更换；

（5） 包装空间大，最高可插入8K目的基因。

（6） 采用柱纯化工艺，纯度更高，滴度高达1010~1011 pfu/mL。

图1 AdMAX系统重组过程示意图

Biowit腺病毒包装技术路线：

服务流程：

您只需给我们提供详细的基因信息，选定的所需的腺病毒载体，我们就能为您生产出符合您要求的带有目的基因的腺病毒。

另外百恩维生物经过鉴定与质量控制：载体测序鉴定、荧光法测定滴度、感染活性测定等，保证给您提供的病毒正确可靠。

Biowit腺病毒感染细胞实例：      

腺病毒概述

腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种无包膜的线性双链DNA病毒，基因组长约35000 bp，理论上可编码22~40个基因，两端各有长约100~150bp的末端反向重复序列（ITR），在其左端ITR3，端为长约300bp的包装信号（Ψ）。病毒颗粒直径约80~110 nm，病毒衣壳有252个壳粒，呈规则的正二十面体面体结构，其中包括240个六联体和12个位于正二十面体顶部的五联体构成。

腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染，但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。

利用基因工程手段将腺病毒基因组DNA改造成多种基因操作表达载体，目前常用的腺病毒包装系统有：AdMax系统和AdEasyTM系统。

AdEasyTM包装系统 

AdEasyTM 包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌（BJ5183）中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染HEK293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。

使用这个系统需要注意以下问题： 

（1） 要用能表达Cre重组酶的特定的大肠杆菌，建议建立菌种库以免细菌发生变化；

（2） 由于重组是在细菌中发生的，微小的基因组变化不易发现； 

（3） 要获得高品质的重组腺病毒毒种（高病毒产量、高目的基因表达）应挑选多个重组腺病毒质粒，分别转染HEK293细胞，获得多个重组病毒来筛选。

AdMax包装系统 

AdMax包装系统是通过Cre/loxP 获得重组病毒，这个过程发生在HEK293细胞中，从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高等。

与AdEasy系统相比，AdMax系统有一定的优势：只需要3~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18~34%（Stratagene公司新版的AdEasy XL系统成功率在94%左右），且在细菌（BJ5183）中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

腺病毒载体有下列优点：

1、腺病毒的基因结构与功能研究的比较清楚；

2、可装入基因的容量较大（8K）；

3、转染范围广，转染率较高，所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力；

4、不整合到靶细胞基因组，无插入突变，无致癌性，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害；

5、可以复制出滴度高（可以达到1011 pfu/mL）、稳定性好、基因转移效率高的病毒；

6、适用于在难以转染的细胞中进行的RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和In Vivo实验。