PCRFast® CTAB基本DNA提取法
IF/EK1001

简要介绍

一般的提取程序是按照CTAB法（原始和改进的方法）从食品和动物饲料中提取DNA。该试剂盒包含足以50次样品DNA提取所需试剂量。
CTAB法抽取DNA（原始方案）
先用氯仿逐步清洗，然后采用CTAB法DNA沉淀
10个样品所时间：90分钟
CTAB法抽提DNA（改进方案）
氯仿逐步清洗及CTAB沉淀DNA同时进行。
裂解后氯仿纯化，然后DNA沉淀
10个样品需要时间：40分钟
1 试剂盒简介
 PCRFast®CTAB提取DNA试剂盒专门设计的采用CTAB法（原始和改进方案）对食品、动物饲料样品中DNA进行抽提所需要的试剂盒。提取试剂盒是符合ISO21571文件所规定的一种食物、基因改良生物体及其衍生物检测的分析方法的核酸萃取法。
大多数情况下，这种方法得到的DNA可以直接用于随后的PCR反应。是否需要纯化，主要取决于基质，有的DNA需要经过纯化的步骤（如使用PCRFast®DNA纯化试剂盒）。
2 试剂盒组成
1个裂解液C（550ml）
1个沉淀液C（110ml）
1个吸附缓冲液C（5.5ml）
1个悬浮缓冲液C（25ml）
1个肝糖（200ml）
1个蛋白激酶K（25mg，冻干）
1个蛋白激酶K缓冲液C（1.5ml）
3 另外需要的仪器和试剂
37°C干燥箱，
旋涡震荡器
60°C摇床
高速离心机，14000g/min，能用于2ml离心管
离心机，2700g/min，能用于50ml离心管
微量移液器：2 - 20 μl, 20 - 200 μl, 100 - 1,000 μl
氯仿
异丙醇（99.9%）
变性的70%乙醇
0.1 x TE缓冲液（Tris 1 mmol / l, EDTA 0.1 mmol / l）
50ml带盖并且有刻度的离心管
2.0ml的反应瓶（耐氯仿）
4 注意事项
所有的工作都应该在遵守基本实验室规定的基础上操作。
为了避免交叉感染，实验过程中都要带手套和口罩。
样品制备、PCR设置和检测应该在不同房间进行。
5 储存方法
该提取试剂盒能在常温下（28°C）保存1年以上。
6  DNA抽提
6.1 抽提预准备
（1）摇床预热至60 °C。
（2）用1.5 ml 蛋白激酶 K缓冲液C将将蛋白激酶K悬浮，此液体可在4 °C条件下保存六个月，其他液体可以分装并于- 20 °C冷藏。抽提前
（3） 第一次用裂解液C和沉淀液C之前必须在60 °C条件下加热30 minutes。
（4）用后的溶液应冷却到室温，并且可以在室温(最高不超过28 °C)储存。
6.2  抽提
下面描述两种DNA抽提方案。原始的CTAB法提取DNA方法 (cf. 6.2.1)主要通过CTAB沉淀非常纯的DNA。这些抽提的DNA可以直接用来下一步的PCRFast®检测试剂盒做进一步分析。
改进的CTAB法(cf. 6.2.2)不用CTAB沉淀，能更快更容易操作；但它经常需要另外的DNA纯化过程(如PCRFast®DNA纯化)。因此，这并不是所有实验都适合。
6.2.1 CTAB法抽提DNA（原始方案）
对于每一个连续抽提来说，保留一个没有实验材料的分析结果，仅仅以ETC控制试剂。每个样品分为两个实验部分，需重复得到结果。此方案是试验部分的典范。
（1）精确称量2 g的均匀样品置于50 ml离心管中，再加10 ml 裂解缓冲液C和25 μl蛋白激酶K溶液 (来自6.1) ，然后用力震荡，保证样品材料均匀分布。注意：对高膨胀性样品材料（如淀粉），精确称量2 g均匀样品，放置50 ml离心管中，加20 ml 裂解液C和25 μl蛋白激酶K溶液(来自6.1)，然后用力震荡，保证样品材料均匀分布。
（2）把来（1）完成的离心管放置60℃摇床上90 min（或过夜），然后冷却至室温（小于30℃）
（3）以2,700g 以上转速离心5 min。
（4）取（3）离心管中的上清液1 ml 放置于2.0 ml反应管中。（脂类样品层应用移液管），以14,000g 以上转速离心10 min。
（5）将450 μl氯仿（或ReadyRed）加入2.0 ml耐氯仿反应管，然后取（4）中上清液750 μl加入每个反应管中，用剧烈震荡15秒（漩涡振荡器）。
    （6）以14,000g 以上转速离心10 min。（若上清液不清澈，再离心5 min）
    （7）加1 ml沉淀液C到一个2.0 ml反应管，再加（6）中上清液500 μl的，之后剧烈震荡15秒（漩涡振荡器）。
（8）4 °C条件下孵育60 min（或过夜）。
（9）以14,000g 以上转速离心10 min（若结块沉淀不明显，继续离心）。
（10）小心的用吸液管移去上清，然后用200 μl悬浮缓冲液C溶解沉淀，再加400 μl氯仿并剧烈震荡15秒（漩涡振荡器）。
（11）以14,000g 以上转速离心10 min（若上清液仍不清澈，再离心5 min）
（12）取210 μl异丙醇加入一个2.0 ml反应管，并取（11）上清液350 μl加入，另外吸取2μl甘油加到反应管的瓶盖上，盖严反应管的盖子并混好，然后用旋涡仪混匀15秒。
（13）以14,000g 以上转速离心10 min。
（14）用吸液器小心移去上清液，然后加500 μl乙醇(70 %)并震荡（若有管壁上附着结块，继续震荡直到掉下来为止，若没有明显出现结块，继续下一步操作）
（15）以14,000g 以上转速离心10 min。
（16）用吸液器小心移去上清液，再次离心（以14,000g 以上转速离心15s），用移液器移去剩下的乙醇并在37 °C吹10 min（或室温干燥1小时），将残留的乙醇去除。
（17）加100 μl吸附缓冲液C溶解沉淀物，并用振荡器混匀；如果微溶性颗粒在超声波浴或在4℃过夜后重新悬浮，那么应该通过振荡溶解。
（18）取（17）液体12.5μl或其相应的冲淡物用于PCRFast®检测试剂盒的分析。
注意：
（1）不足100ng的DNA能用于检测，通过260 nm紫外线测定或琼脂糖凝胶估计。
（2）经验表明DNA抽提样品中DNA含量过高（大豆粉，玉米粉，香肠样品等），因此要用0.1 x TE 缓冲液冲淡。
6.2.2 利用CTAB法对DNA抽提（改进方案）
对于每一个连续抽提来说，保留一个没有实验材料的分析结果，仅仅以ETC控制试剂。每个样品分为两个实验部分，需重复得到结果。此方案是试验部分的典范。
（1）精确称量2 g的均匀样品置于50 ml离心管中，再加10 ml 裂解缓冲液C和25 μl蛋白激酶K溶液 (来自6.1) ，然后用力震荡，保证样品材料均匀分布。注意：对高膨胀性样品材料（如淀粉），精确称量2 g均匀样品，放置50 ml离心管中，加20 ml 裂解液C和25 μl蛋白激酶K溶液(来自6.1)，然后用力震荡，保证样品材料均匀分布。
（2）把来（1）完成的离心管放置60℃摇床上90 min（或过夜），然后冷却至室温（低于30℃）
（3）以2,700g 以上转速离心5 min。
（4）取（3）离心管中的上清液1.5 ml 放置于2.0 ml反应管中。
（5）以14,000g 以上转速离心10 min。（若上清液不清澈，再离心5 min）
（6）将600μl氯仿（或ReadyRed）加入2.0 ml耐氯仿反应管，然后取（5）中上清液900 μl加入每个反应，用剧烈震荡15秒（漩涡振荡器）。
（7）以14,000g 以上转速离心10 min。（若上清液不清澈，再离心5 min）
（8）取500 μl异丙醇加入一个2.0 ml反应管，并取（7）上清液625 μl加入，另外吸取2μl甘油加到反应管的瓶盖上，盖严反应管的盖子并混好，然后用旋涡仪混匀15秒。
（9）以14,000g 以上转速离心10min。
（10）用吸液管小心的移去上清（注意：对于DNA含量低的样品，沉淀颗粒有可能看不见，仍然继续所用操作），加入500 μl 70％乙醇并震荡（如有大块沉淀颗粒附着在反应管壁上，继续震荡直至固体颗粒消失）。
（11）以至少14,000 x g离心10 min。
（12）用吸液器小心移去上清液，再次离心（以14,000g 以上转速离心15s），用移液器移去剩下的乙醇并在37 °C干燥箱里10 min（或室温干燥1小时），将残留的乙醇去除。
（13）加100 μl吸附缓冲液C溶解沉淀物，并用振荡器混匀；如果微溶性颗粒在超声波浴或在4℃过夜后重新悬浮，那么应该通过振荡溶解。
（14）取（13）液体12.5μl或其相应的冲淡物用于PCRFast®检测试剂盒的分析。
注意：
（1）若（13）步骤溶液重新悬浮后是混浊的，那么应该过硅胶柱纯化（如PCRFast®DNA纯化）。
（2）在某些情况下采用硅胶柱纯化是必要的，如大豆产品（豆粉或黄豆）巧克力或含可可粉的产品。
这种情况下（13）步骤中的100μl DNA提取液过硅胶柱。
（3）不足100ng的DNA能用于检测，通过260 nm紫外线测定或琼脂糖凝胶估计。
（4）经验表明DNA抽提样品中DNA含量过高（大豆粉，玉米粉，香肠样品等），因此要用0.1 x TE 缓冲液冲淡。
（5）DNA提取液有抑制反应（含可可粉、巧克力的食品原料）必须用0.1 x TE 缓冲溶液稀释。