实时荧光定量PCR（qPCR）技术服务

1. 服务简介

   实时荧光定量PCR技术是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们使用这种方法进行广泛的应用研究。实时荧光定量PCR的主要优点是能够准确地确定初始模板拷贝数，具有较宽的动态范围以及较高的灵敏度，满足定性和定量实验的需求。
   江苏楚天生物用自己研发生产的基因表达定量产品为客户提供完整的mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等表达定量服务。客户只需提供样品，我们即可提供基因表达定量结果。

服务优势 

①. mRNA

引物设计更加专业、细致

a. 引物设计涵盖该基因的所有转录本，完整定量一个基因的表达；

b. 引物不含 SNP 位点，不会因为个体基因多样性而导致定量差别；

c. 引物不会位于基因组重复序列内；

d. 引物专一性得到 BLAST 分析的验证，绝大多数引物在目标序列与非目标序列相差 3 个碱基以上；

e. 绝大多数引物设计跨越剪接区域，只扩增成熟 mRNA， 极大程度避免 RNA 样品中残余基因组 DNA 对体系的影响；

f. 建立引物数据库， 统计每对引物 Tm值的置信区间，以监控引物是否正常运行。

② microRNA

江苏楚天生物第三代 miRNA 检测技术

   miRNA 由于自身结构较为特殊，片段长度较短（约为 22 个碱基），无法直接应用 PCR 技术进行扩增。针对该特性，必须要延伸目标 miRNA 的长度，构建一个足够长的 PCR 模板。目前使用较多的方法为 PolyA 加尾法和通用型茎环引物法。加尾法可以检测到成熟 miRNA 及 pre-miRNA，特异性稍低；茎环法只针对成熟 miRNA，特异性相对较高。
   但是目前越来越多的实验发现，在检测目的miRNA时，通用型茎环引物并不适用于所有miRNA，并且在加入无模板中反应后，会发现实验本地过高，造成一定的实验误差。
   江苏楚天生物（CT Bioscience）通过持续的研发工作，已升级到第三代 miRNA 检测方法——即为每个 miRNA 都设计专门的反转录茎环引物，大大增强检测效果。我们的 miRNA PCR 芯片采用 SYBR Green I 实时荧光 PCR 进行准确定量，并根据不同 miRNA 的功能特性，研发出专题应用的 miRNA PCR 芯片。在楚天生物独特的体系设计下，使得所有 miRNA 可以在统一的条件下高效扩增。

主要特点：

1. 为每个 miRNA 都设计专门的反转录茎环引物， 解决了一种通用的茎环引物难以匹配所有 miRNA 的问题， 以及 miRNA分析相互干忧的问题，并且极大程度降低本底，提高准确性；

2. 优化反应条件，大大缩短检测时间，约 1 个小时即可在 Roche 480 II 上完成实验检测；

3. 提高检测灵敏度，检测范围高达7个数量级，应用低至 50ng exosome 提取的总 RNA，也能得到较好的实验结果！ 

③ lncRNA

　　lncRNA ( Long noncoding RNA，长链非编码RNA ) 是一类长度超过200个碱基的长链非编码RNA分子，可在多种层面调控基因的表达。它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式调控基因的表达。近年来研究表明，lncRNA参与X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，其调控作用开始引起人们广泛关注。

Ⅰ 引物设计独特：
   研究发现，众多 lncRNA 序列之间相似度较高， 并且它们与部分 mRNA 的序列也存在较大相似性，怎样准确且特异性识别目标序列，成为关键。楚天生物秉承独有的引物设计理念，通过巧妙识别特异位点，大幅提高检测准确性。
 
Ⅱ lncRNA 检测效果最佳：
   相比于mRNA，lncRNA 的表达量较低，楚天生物 PCR 芯片能够完美检测低丰度 RNA。
 
Ⅲ 品质可靠：
   精心设计和反复验证的实验体系。

④ circRNA

　　circRNA（Circular RNA，环状 RNA）是近年来发现的一类新的具有调控功能的非编码 RNA，它存在于各种生物体中，具有牢固的环状结构、物种保守性以及组织特异性，不易被核酸酶裂解。它是一类特殊的内源性 RNA 分子，有别于传统线性 RNA。在真核生物体中，大部分 circRNA 是由外显子构成（也有内含子甚至 tRNA）。

重点与难点：引物设计

  circRNA 分子呈封闭环状结构，这与传统的线性 RNA（linear RNA，含 5’和 3’末端）不同，在进行 qPCR 实验时，怎样进行有效的引物设计即为关键。楚天生物采用 “背靠背” 式的引物设计理念， 根据 circRNA分子的结构特性，在其特异的拼接位点两侧设计引物，这有别于传统线性 RNA 的引物设计。

2. 接受样品类型

a)    组织样品（需提供≥100mg组织。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；
b)    体外培养细胞（需提供≥10^6个细胞。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；
c)    全血（需提供≥2ml全血）；
d)    总RNA（需提供≥5ug total RNA）；
e)    其他样品，请来电或邮件咨询。
 
   所有类型样品必须用冰袋或干冰寄至公司。冰袋或干冰应足量，以确保样品寄至公司时，冰袋或干冰未完全融化。使用invitrogen品牌TRIzol试剂，按以上指导方法邮寄样品，3天内不会影响RNA质量。
 


3. 服务内容

① 引物设计与合成       由江苏楚天生物提供实验所需引物；
② RNA抽提纯化         在组织或细胞样品中加入TRIzol试剂（invitrogen），匀浆或裂解后抽提RNA；
③ 基因组DNA消化处理     使用DNA消化液消化基因组残余DNA，最大程度降低实验干扰；
④ RNA质量检测         使用Denovix DS-11超微量分光光度计测定样本RNA浓度和纯度；
⑤ cDNA合成           将mRNA反转录为cDNA；
⑥ 实时荧光定量PCR检测    加入cDNA和反应液，在Roche 480 Ⅱ中进行扩增和检测；
⑦ 提交实验数据和报告     服务报告提交下列数据：实时荧光定量PCR扩增曲线；熔解曲线；基因表达定量结果分析，图表等。
 

4. 服务价格
 

 

5. 服务报告提交时间

      收到样品后10-15个工作日。

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