Rat TIMP-1 ELISA KIT
品牌：Solarbio | 货号：SEKR-0031

中文名称
大鼠基质金属蛋白酶抑制剂1检测试剂盒
英文名称
Rat TIMP-1 ELISA KIT
反应性
Rat
样品类型
Serum, plasma, Cell culture supernatant
灵敏度
16 pg/ml
检测目标
TIMP-1
应用
Sandwich ELISA

背景介绍：
大鼠 TIMP-1 是一种 28-35 kda 分泌的糖蛋白，它是一种含 23 aa 信号肽和 194 aa 成熟型的 217 个氨基酸前体，大鼠 TIMP-1与小鼠、人、猪和狗的同源性分别为 85%、70%、68%和 66%，其中 TIMP-1 与小鼠、人、猪和犬的同源性分别为 40%和 35%。TIMP-1 在成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、颗粒细胞、树突状细胞、血管平滑肌细胞、脂肪细胞和单核细胞中广泛表达。所有 TIMP 蛋白都有 12 个保守的半胱氨酸残基，形成 6 个内二硫键，形成一个非常稳定的蛋白，有 6 个环状结构。TIMP蛋白有两个结构和功能上不同的结构域：n 端结构域，由环 1~3 组成，与活性 MMPs 在 1：1 化学计量学中紧密结合，但非共价结合；c-末端结构域由增强酶抑制剂相互作用的循环 4-6 组成。在 TIMP-1 的情况下，c-末端结构域也被证明能结合前 MMP-9的血友病样结构域。TIMP-1 刺激促红细胞生成，抑制血管生成，是 b 细胞的抗凋亡剂。 

检测原理：
Solarbio (Solarbio ®)ELISA 试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗大鼠 TIMP-1单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的大鼠 TIMP-1会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗大鼠 TIMP-1 抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的大鼠 TIMP-1 发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物 TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的大鼠 TIMP-1，则 HRP 会使无色 TMB 变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的大鼠TIMP-1 浓度与 OD 成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中大鼠 TIMP-1 的浓度。

注意事项：
1. 试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2. 试剂盒未使用时应保存在 2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3. 试剂盒使用前请在室温恢复 30 min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4. 在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5. 为避免交叉污染，请在试验中使用 1 次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。. 

6. 浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10 S 即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。
7. 除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8. 为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。 

安全提示：
试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。

自备实验器材（不提供，可代购）
1． 酶标仪（主波长 450nm，参考波长 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板机或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 双蒸水，去离子水，量筒等
6． 稀释用聚丙烯试管
样本收集及储存：
1. 细胞培养上清：
将细胞培养基移至无菌离心管，在 4℃条件下 1000 ×g 离心 10 min,然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
2. 血清样本：
室温血液自然凝固 20 min 后，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于4 或-20℃下保存（24 小时内检测可放入 2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3. 血浆样本：
将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择 EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 20 min，在 4℃条件下 1000×g 离心 10 min，然后将上清等量分装于小 EP 管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入 2-8℃储存），避免反复冻融。
※注意：

血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。 

试剂准备：
1. 试剂回温：首先在实验前 30 min 将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
2. 配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤液稀释成 1 倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入 4℃冰箱保存。
3. 标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后按照以下浓度： 2000、 1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液（2000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。

6. 洗涤方法：
 自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为 300ul/孔,注与吸出间隔为 30 秒，洗板 5 次。
 手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液 300ul/孔，静止30 秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板 5 次。

结果判断：
1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测，参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测，请用 450 nm 的 OD 测定值减去 630 nm 的 OD 测定值。
2.计算标准品、样品的平均 OD 值：每个标准品和标本的 OD 值应减去零孔的 OD 值
3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TIMP-1含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

4.若标本 OD 值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。

2. 灵敏度：
最低可检测大鼠 TIMP-1 浓度达 15pg/ml，20 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。
3. 特异性：
不与小鼠 MMP-3、MMP-9 (active)、MMP-9 (pro)人的 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-12、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4 等反应
4. 重复性：
板内，板间变异系数<10%