Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus

（酵母裂解酶-100T来自藤黄节杆菌）

-----MP Biomedicals New Zealand Limited

简述： 

   Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通过Arthrobacter luteus(藤黄节杆菌)深层培养获得的酶制剂，它能有效的裂解活酵母细胞细胞壁。该制剂是利用亲和层析法部分纯化获得的冻干酶，其酶活单位是100,000 单位/g.其中主要负责裂解活酵母细胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通过对ß-1,3-葡聚糖连接位水解葡萄糖聚合物，释放产物主要是昆布五糖。

产品说明：

单位定义：800nm条件下菌液吸光度下降30%，表示一个活力单位。

特异性：此产品的裂解谱包括以下属的生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于细胞裂解、原生质球形成及葡聚糖水解。

说明:酵母细胞的裂解程度随酵母菌的种类、生长阶段及培养条件而改变。

声明: Zymolyase是麒麟麦酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注册商标。

储存:冻干状态于2-8°C中保存，若30°C下放置3个月约失去90%活力。

外观:冻干粉

活力：100,000单位/g

核心酶：ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶，约1.0 x 107 单位 /g

         蛋白酶，约1.7 x 104单位 /g

甘露聚糖酶, 约6.0 x 104单位 /g

 淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未检出）

催化剂：二硫苏糖醇（DTT）, ß-巯基乙醇及其他的巯基化合物（如半胱氨酸）

最适pH及温度：

     pH 7.5, 35°C裂解活酵母细胞

     pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范围：pH 5-10间保持稳定

热稳定性：60°C，5min丧失细胞溶解能力

警告：（1）ZymolaseØ-100T溶解度低，以悬浮液的状态使用。如果需制备浓度超过0.05%的无菌酶溶液，则通过将ZymolaseØ-100T溶解在含5%葡萄糖的缓冲液中（pH 7.5），首先配制2%的酶储存液；（2）吸取悬浮液，留下沉至容器管底的任何物质；（3）不推荐使用**纤维过滤器；（4）稀释无菌的酶悬浮液至目标浓度。

原生质球制备程序：

1.      室温条件，5000rpm（3000 xg），5min离心酵母培养物；

2.      收集离心沉淀物（酵母细胞）并记录湿重；

3.      用TE缓冲液悬浮细胞，加入量为1.4ml/g湿重细胞；（TE缓冲液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4.      双蒸水快速定容，终体积量为3.5ml/g湿重细胞；

5.      按照17.5 ul (总体积的1/200)/ g湿重细胞的量加入ß -巯基乙醇（MP 806445），目的是为了除去细胞外层中的甘露聚糖层；

6.      30°C轻摇温育混合液，处于对数期生长的培养物处理15min，处于稳定期生长的培养物处理45min；

7.      室温条件，5000rpm离心5min；

8.      用S缓冲液重新悬浮细胞，加入量为4.0ml/g湿重细胞；（S缓冲液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9.      5000rpm离心5min；

10.   再次用S缓冲液（4.0ml/g湿重细胞）悬浮细胞，另外加入Zymolyases（50U /g湿重细胞）；如果Zymolyases配制成附录所示的溶液，则添加250ul即可。最好根据实验情况最先优化酶使用量。

11.   30°C轻摇温育混合液30min，根据以下方式监测原生质球形成程度：

（1）         加1ul样品到20ul S 缓冲液内，原生质球应该保持完整；

（2）         加1ul样品到20ul双蒸水中，原生质球应该破裂；显微镜下观察比较两个样品的形态差异。

12．一般情况下反应45-60min，原生质球的形成量>90%，此时4oC下离心收集细胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S缓冲液（2 ml/g湿重细胞）悬浮原生质球，5000rpm离心5min；重复此步骤做第二次清洗；；

14.原生质球离心沉淀物-70oC冻存。

裂解原生质球获取细胞核： 

   温和的裂解原生质球方法如下; 用3倍体积的18%Ficoll（MP 160003）溶液悬浮细胞离心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 (MP 195088)的10 mM PIPES 缓冲液内，pH 6.5。

酵母菌基因组DNA的制备： 

 以下步骤快捷，适合于从少量酵母培养物中制备基因组DNA ：

1.     将过夜培养的10ml酵母菌培养物离心收集细胞，加入280ul TE Buffer（配方见原生质球制备程序中的步骤3），300 ul双蒸水，3 ul ß -巯基乙醇（MP 806445）；

2.     30oC温育45min；

3.     以台式离心机的最高速度离心2-3s，弃上清液，沉淀物用500 ul S 缓冲液（配方见原生质球制备程序中的步骤8）悬浮.；再次离心弃上清；

4.     用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S缓冲液悬浮细胞沉淀物（或者使用自己认为最合适的酶浓度）；

5.     30oC温育1小时；

6.     重复步骤3；

7.     用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 缓冲液悬浮细胞沉淀物；

8.     37oC温育3小时，不时的混匀溶液；

9.     调水浴锅的温度至65oC，并温育20min；

10.  从水浴锅内取出并冷却至室温；

11.  用200ul 1:1的Tris饱和酚-氯仿混合液萃取，漩涡混匀并离心；从离心机内取出并保留上清液；

12.  用200ul氯仿萃取上清液，之后重复漩涡混匀及离心；

13.  加入500ul95%乙醇到上清液内，20oC沉淀10min；

14.  4oC下，15,000 xg离心20 min；

15.  自然风干或者于真空离心蒸发浓缩器内晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE缓冲液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16.  37oC温育1小时；

17.  重复步骤11和12；

18.  加入2.5倍体积的95%乙醇，20oC沉淀10min；

19.  30ul双蒸水重悬DNA。对1:500的DNA稀释液测量A260，根据消光系数计算DNA产量；

20.  产量大约为40-50ug。

附录:

制备Zymolyase 100T溶液：

以下配制的溶液适用于该产品的实验程序中（但并不排除其他类型的母液也适用）

配制200单位/ml的母液，将冻干粉溶于已高压灭菌的S缓冲液（配方见原生质球制备程序中的步骤8）。

如果不被微生物污染，于4 oC下，此母液能2个星期以上时间内保持高效；

参考文献：

1.      Kaneko, T., Kitamura, K. and Yamamoto, Y., J. Gen. Appl. Microbiol. 15, 317, 1969. 

2.      Kitamura, K., Kaneko, T. and Yamamoto, Y., Arch Biochem. Biophys. 145, 402, 1971. 

3.      Kitamura, K. Kaneko, T. and Yamamoto, Y., J. Gen Appl. Microbiol. 18, 57, 1972. 

4.      Kitamura, K. and Yamamoto, Y., Arch. Biochem. Biophys. 153, 403, 1972. 

5.      Kaneko, T., Kitamura, K. and Yamamoto, Y., Agric. Biol. Chem. 37, 2295, 1973. 

6.      Kitamura, K., Kaneko, T. and Yamamoto, Y., J. Gen. Appl. Microbiol. 20, 323, 1974. TUNEology 波长可调检测卡盒-->