hsa-mir-21 TuD RNA封闭载体构建

摘要：设计针对hsa-mir-21的TuD RNA封闭片段。通过分子生物学手段将该封闭片段构建入腺病毒载体（pAdeno-RNAi-U6-CMV-EGFP）的U6启动子下游，该载体可以实现在封闭hsa-mir-21的同时表达绿色荧光蛋白EGFP，便于观察载体工作状态。除了可以直接瞬时转染细胞用于hsa-mir-21的封闭，该载体也可以包装腺病毒， 用于动物水平封闭hsa-mir-21。
关键词：TuD RNA，hsa-mir-21封闭， adenovirus vector， EGFP

一、 实验原理

                                                                            TuD RNA 原理示意图

如图所示，TuD RNA（Tough Decoy RNA）是一个包含两个miRNA互补序列（MBS）的序列。该序列在转录之后会形成如图所示的相对稳定的茎环状结构，并被转运到细胞质中。通过与目标miRNA互补的序列来封闭目标miRNA的功能。表达载体pAdeno-U6-CMV-EGFP图谱如下：

二、 实验目的
构建带有EGFP荧光标记的hsa-mir-21封闭（TuD RNA）腺病毒载体。

三、 实验方法
TuD RNA-hsa-mir-21为封闭hsa-mir-21序列，以化学合成的TuD RNA-hsa-mir-21基因通过双酶切得到目的基因片段。表达载体酶切后回收线性化的载体片段。目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。实验步骤如下：

1. TuD RNA的化学合成：
从miRBase中查询到hsa-mir-21的序列，并设计其TuD RNA序列，上下游酶切位点分别为Age I和EcoR I，安排化学合成。
2. 制备线性化TuD RNA表达载体：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
3. 胶回收目的基因片段：
把化学合成的TuD RNA进行酶切得到目的基因片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 目的基因连接入表达载体：
                                         将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比3:1加到离心管中： 
   

        于16℃ 连接过夜，第二天取10μl反应液体转化到100μl感受态细胞中。

5. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
6. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

                                                                       
7. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
8. 质粒小提：
测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. 酶切获得目的基因片段：
用 Age I和EcoR I对化学合成的目的基因进行酶切，胶回收135bp的目的基因片段。酶切图谱如下：

                                                                1     2    3
                                                           

1. 用 Age I和EcoR I对化学合成的pTuD-NC 进行酶切
2. 用 Age I和EcoR I对化学合成的TuD RNA-hsa-mir-21 进行酶切
3. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

2. 表达载体的线性化：
用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收5.1kb的载体片段，酶切图谱如下：

                                                                     1     2   

1. 线性化表达载体
2. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中，反向引物pY-SEQR： CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5’序列，阳性克隆得到415bp的片段，空载体得到282bp的片段。电泳结果如下：
                                                               1    2     3    4     5    6    7     8     9    10 

1. 阴性对照（空载体）
2. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
3-10 挑取的8个转化子
接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。

4. 测序结果分析
TuD RNA-hsa-mir-21为封闭hsa-mir-21（hsa-mir-21，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA）序列，其测序结果如下：
GATAAAAATACTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCACTACGCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACGCAGCTGCCGTGCCCTGACCACCCTCGTGACACCTGACTACGGGTGCATGCTTCAGCCGCTACCGGACAATGAGCACACGACCTCTTCAGTTCGCATGCCGAGGCTACGTCAGGGGCCACCATCTTCTTTCAGGAGACGACGGGGCAACTATCTAGAAA
阳性克隆测序结果表明，和预期的序列完全一致，证实该封闭载体构建成功。

五、 参考文献
1. Haraguchi T, Ozaki Y, Iba H.Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009;6-43.
2. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社