人缺失BRCT结构域PES1过表达载体构建

摘要：以人cDNA为模板扩增PES1基因，通过搭桥PCR缺失BRCT结构域(Δ322–415)后替换慢病毒对照载体pLenti-CMV-EGFP- 3FLAG-PGK-Puro中的EGFP。该载体骨架中3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达检测和Western Blot研究，而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达，来研究缺失BRCT结构域对PES1蛋白功能的影响。
关键词：PES1， BRCT， Δ322–415，过表达， 3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
PES1的BRCT结构域为第322-415氨基酸序列，研究缺失了这个BRCT结构域对蛋白功能的影响。PCR扩增PES1(Δ322–415)基因序列，构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体中CMV启动子后面的EcoR I和Xba I多克隆位点，目的基因代替了对照载体的EGFP基因。
pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下：

                                                                 
二、 实验目的
构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的人PES1(Δ322–415)过表达慢病毒载体。

三、 实验方法
PCR扩增的PES1(Δ322–415)基因序列与经由EcoR I和Xba I酶切的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。
菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下：
1. 引物设计：
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的基因：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：

2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：
目的基因PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比，判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段：
把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中：
                             将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比1:1:1加到离心管中进行重组反应：
                                                                              
混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。放置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。
6. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

8. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. PCR扩增目的基因：
目的基因片段a的扩增：用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGGAGGCCTTGAGAAGAAG（含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物GCTGCACCCCCTCCTGCGCCTCCAGCTCC（扩增目的基因1-322氨基酸序列），对人cDNA进行扩增，预期PCR产物大小为999bp。
目的基因片段b的扩增：用正向引物  GGCGCAGGAGGGGGTGCAGCTGCCCCCACAC（扩增目的基因415-588氨基酸序列），反向引物CCAGACGCGGTCTAGATCACTCCGGCCTTGCCTTCTTG（引物说明：含同源重组序列、Xba I酶切位点，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人cDNA进行扩增，预期PCR产物大小为552bp。
电泳结果如下：
                                           1   2              3   4

                                        
1. a片段PCR产物
3. b片段PCR产物
2.4   DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2. 表达载体的线性化：
用EcoR I和Xba I对表达载体进行双酶切，得到810bp和6.9kb的片段，回收6.9kb的载体片段。酶切图谱如下： 
                                             1   2

                                         
1. 载体双酶切片段
2. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物EPS1-SEQF：GGTCTTCCTGTCCATCAAAG位于目的基因序列中，反向引物WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于WPRE序列中，阳性克隆得到1039bp的片段。电泳结果如下：
                                              1   2    3    4    5    6     7    8    9   10   11

1. 阴性对照（ddH2O）
2. 阳性性对照（其他插入片段）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11. 挑取的8个转化子
接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经测序验证正确的，再接种抽提质粒。

4. 测序结果分析：
阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。按要求缺失了第322-415氨基酸序列的BRCT结

      
五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社