SNP检测

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多,SNP也成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关, 例如癌症，糖尿病等疾病，特别是近年来对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。

1.  荧光定量PCR平台SNP检测原理：

荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度等信息，7900是ABI公司最新的高通量实时定量PCR系统，可兼容96/384孔板和TaqMan低密度芯片，满足从中通量到高通量的基因表达定量和SNP多态性实验的需求。

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料Fam，Hex（Vic）分别标记这两种探针，从而在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。

2. MassARRAY飞行时间质谱平台SNP检测原理：

MassARRAY™时间飞行质谱生物芯片系统由专业生产生物芯片系统用于遗传突变及SNP领域研究的美国Sequenom公司开发，是目前唯一采用质谱法直接检测SNP的设备。该系统的突出特点是能以极高的精确度快速进行基因型识别，直接测出带有SNP或其他突变的目标DNA。MassARRAY™系统反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，不需要各种标记物，全自动分析。这套系统及时提供了大规模、高能量检测SNP的技术平台，在当前医学疾病基因组疾病机制研究迅猛发展的背景下，其为寻找与致病机制相关的药物靶点提供线索。

我们的质谱是Maldi-Tof质谱，全称是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。其主要过程是，PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在 SNP 位点上，延伸 1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，不同分子量的分子飞行时间也不同，分子量越大飞行时间越长，根据飞行时间进而判断分子量大小。通过对物质的分子量进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。

SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异。不同的核苷酸之间存在分子量差异，通过实验将差异放大和转化，然后通过质谱仪进行检测,从而确定其碱基类型。

检测目标：   A       or       C    or         T    or    G

延伸物质： ddTTP  or  ddGTP  or  ddATP  or  ddCTP

分子量：   353.2     >   313.2    >   297.2    >   273.2

3.Affymetrix芯片平台SNP检测原理：

美国 Affymetrix 公司是基因芯片产业先行者，早在1989年就研制出了世界首张基因芯片。其开发的寡核苷酸原位光刻合成专利技术(light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays)，是目前最高密度的芯片制备技术。Affymetrix 公司以其完备的芯片设计，稳定可靠的分析结果和强大的生物信息学分析能力，帮助研究人员在短时间内获得大量可靠的结果，为后续研究提供重要的线索和帮助。Affymetrix GeneChip生物芯片检测系统，是由高密度GeneChip芯片和试剂，杂交、扫描仪器，数据处理和分析工具组成的一整套检测平台，是世界上第一种经欧盟和美国FDA审批的可用作体外诊断的芯片系统。

目前用Affymetrix芯片发表的科学文章现已多达3万多篇文章，其中多篇文章发表在nature、science、 cell等世界最高级别的学术刊物上。

Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，利用此技术用很少的步骤可合成大量的DNA阵列。 Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度高达106~1010/cm2。首先使固相片基羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，当光通过避光膜照射到支持物上时，受光部位的羟基就会发生脱保护而活化，从而可以反应结合碱基。由于参与合成的碱基单体一端可以进行固相合成，另一端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进行下一轮的光照、脱保护和固相合成。循环下去，不断改变避光膜的透光位点，就可以实现在同一玻片上合成成千上万种预定序列的寡核苷酸探针，目前市场上有大量SNP检测芯片，同时我公司可以提供SNP检测芯片定制服务。

4. 其他SNP检测技术对比：

4.1 限制性片段长度多态性分析法(RFLP)：
RFLP技术利用限制性核酸内切酶识别并剪切特定DNA序列的能力,检测基因片段上限制性核酸内切酶识别位点处是否存在核苷酸突变。应用限制性内切酶对两个等位基因识别的差异,产生不同大小的切割片段,通过电泳迁移率的不同来判定是否存在SNP。

             仪器：电泳仪、凝胶成像系统；

             优点：简单，成本低廉；

             缺点：能检测SNP位点有限，易污染，通量低。

4.2 单链构象多态性分析法（SSCP）：
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。

             仪器：电泳仪、凝胶成像系统；

             优点：简单，成本低廉；

             缺点：能检测SNP位点有限，易污染，通量低。

4.3 异源双链分析法（HA）：
在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。

              仪器：电泳仪、凝胶成像系统；

优点：简单，成本低廉；

              缺点：能检测SNP位点有限，易污染，通量低。

4.4 变性梯度凝胶电泳法（DGGE）：
当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。

              仪器：电泳仪、凝胶成像系统；

优点：简单，成本低廉；

              缺点：能检测SNP位点有限，易污染，通量低。

4.5 高分辨率熔解曲线分析法（HRM）：

高分辨率熔解曲线分析(HRM)是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。

仪器：实时荧光PCR仪；

优点：无需设计探针，操作简便、快速、成本低；

缺点：通量低，结果准确度不高。

4.6 连接酶检测法（LDR）：

             即在Taq DNA连接酶的作用下,当SNP位点上下游两条寡核苷酸探针与目的DNA序列完全互补，并且两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应，否则连接反应不能进行，最后通过荧光扫描片段长度，实现对SNP 位点的检测。

             仪器：PCR仪、测序仪；

优点：较为准确、简单。

             缺点：通量较低、用酶的地方多，易出错。

4.7 DNA测序法（DNA sequencing）
双脱氧终止法，引物用四种不同颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行。

           仪器：PCR仪，测序仪；

           优点：准确度高，

           缺点：成本高，通量低。

4.8 SNaPshot法：

该技术是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。

仪器：PCR仪，测序仪；

优点：准确度高；

缺点：对引物设计要求高，成本高，通量稍低。

5. 应用服务：

5.1 基因组制图中的应用

     目前已知超过500万个SNP位点，将SNPs 与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合起来以期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传和基因组扫描等方面做进一步研究；

5.2 在种族遗传学的应用

        确定种族地域性，及种族归属等；

5.3 医学中疾病易感性研究中的应用

        SNPs 被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过非患者时,即表明该标记与疾病关联,通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性,可将基因组中任何未知的致病基因定位；

5.4 药物基因组学研究中的应用

        SNPs 可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择合适的受试者,提高效率,减少费用；

5.5 遗传育种的应用

        研究优良性状与SNPs的关联关系，指导育种。