细胞免疫荧光实验

摘要：在293T细胞中过表达human pescadillo（PES1）基因，利用免疫荧光技术研究PES1在细胞中的表达和定位。实验结果表明PES1定位于细胞核的核仁。该实验结果为进一步深入研究PES1基因的功能提供实验数据。
关键词：PES1，免疫荧光， 蛋白定位，293T

一、 实验原理
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

二、 实验目的
使用过表达PES1-3FLAG的慢病毒感染293T细胞，利用Anti-FLAG抗体进行免疫荧光，观察PES1蛋白的表达以及在细胞中的定位。

三、 实验步骤
1. 细胞铺板：
细胞铺板：将细胞按20-30%的汇合度接种到24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上。
2. 病毒感染：
病毒感染：细胞贴壁后使用PES1过表达慢病毒感染细胞，MOI =10。
3. 免疫细胞化学染色：
1) 固定：病毒感染72h后，吸去细胞培养液，每孔用500μl DPBS洗细胞2次，之后每孔加250μl 4% 多聚甲醛，室温固定15-20min。
2) 封闭：封闭液配制如下：
                  94%    0.1M TBS
                  3%     Normal Goat Serum
                  3%     10% Triton X-100
去除TBS，24孔板每个孔加入500μl封闭液，室温孵育1h封闭。
3) 染一抗：吸出封闭液，每个孔再加入500μl封闭液，根据1:1000加入一抗，4℃孵育过夜。
4) 染二抗：一抗染色结束后，移去含一抗的封闭液，用1ml TBS洗三次。吸出TBS，每个孔加入500μl封闭液孵育30min。按1:500加入二抗，室温摇晃孵育60-120min。可在孵育60min后加入终浓度为100ng/ml的DAPI继续孵育。由于二抗带有荧光标记，荧光信号容易淬灭，加入二抗及之后的过程需注意避光。二抗孵育结束后，移去含二抗的封闭液，用1ml TBS洗三次，可直接在荧光显微镜下进行观察或者进行封片保存。
5) 封片：在载玻片是滴一小滴mounting medium，小心地将cover slip从细胞培养板中取出，种植有细胞面朝下轻轻地盖在mounting medium。4℃孵育过夜晾干。过程中要注意避免产生气泡，mounting medium很粘稠，滴加的时候需小心。

4. 共聚焦荧光显微镜拍照：
封片后可在荧光显微镜下进行观察，亦可置于4℃长期保存。

四、 实验结果

                                                                      图1. 低倍镜观察PES1蛋白在293T细胞中的定位

                                                                         图2. 高倍镜观察PES1蛋白在293T细胞中的定位

 从实验结果可以看到PES1蛋白定位在细胞的核仁位置。

五、 参考文献
1. Griffiths G, Parton RG, Lucocq J, van Deurs B, Brown D, Slot JW, Geuze HJ. The immunofluorescent era of membrane traffic. Trends Cell Biol. 1993 Jul;3(7):214-9.
2. Garini Y, Vermolen BJ, Young IT. From micro to nano: recent advances in high-resolution microscopy. Curr Opin Biotechnol. 2005 Feb;16(1):3-12.
3. Tokuyasu KT. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. J Ultrastruct Res. 1978 Jun;63(3):287-307.
4. EM, Horstmann H, Almers W, Maniak M, Soldati T. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 1998;121(3):326-42.
5. Neuhaus EM, Almers W, Soldati T. Morphology and dynamics of the endocytic pathway in Dictyostelium discoideum. Mol Biol Cell. 2002 Apr;13(4):1390-407.