环境微生物群落多样性分析

在环境微生物生态学的发展过程中，有三个进展是至关重要的：一，分子技术在该领域的应用，克服了自然界微生物纯培养的局限，大大扩展了我们在整体上对自然环境微生物的认知范围；二，将宏观生态的思想和方法引入微生物生态研究，极大地提高了我们对微生物多样性的认知水平；三，第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系，环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。

1． 采用定向测序技术，避免了非定向 测序造成的数据冗余，能充分利用每条有效序列，且便于后期的菌群分类处理。

2． 开发了一套稳定的多样本平行测序实验方案，并解决了样本间数据不平衡的技术难题，一次可实现200个样品的平行测序。

3． 众多的成功案例，使迪奥生物在环境微生物群落多样性测序及分析方面处于国内领先地位。

1. 细菌扩增区域（16SrDNA）

1) 一般选择V3区和V6区。

2) 其它备选区域：V1+V2,V2,V4,V5+V6,V6+V7

3) 引物设计参考：

   区域        通用引物

  V1+V2       8F-338R

  V2           27F-338R

  V3           341F-534R

  V4           530F-805R

  V5+V6        805F-1046R

  V6            967F-1046R

  V6+V7        967F-1220R

2．真菌扩增区域

1）一般选择：V4,V9,ITS

2)引物设计参考：

   区域          通用引物

   V4           528F-706R

   V9           1380F-1510R

   ITS           ITSIF-ITS2

   SSU           NF1-18Sr2b

   LSU           D3A-D3B

1. 多个环境样品可以同时进行高通量深度测序。

2. 样品之间的测序数据通过扩增时引入的标签（tag）进行区分。

3. 迪奥生物开发出了一套稳定的多样本平行测序实验方案。

4. 迪奥生物提供的tag序列均经过Roche和迪奥生物的实验检验。

5. 多样本平行测序成功的关键是样品间的测序数据量趋于一致，迪奥生物拥有样品间数据量不平衡问题的解决方案。

6. 迪奥生物可以帮合作伙伴实现200个样品的平行测序。

环境样品测序深度

1. 不同环境样品中微生物的丰富度差别很大，所需的测序深度也不同。

2. 研究目的决定了环境微生物的检测精度，而检测精度决定了测序深度。

3. 迪奥生物拥有丰富的成功案例，针对不同的环境样品和研究目的，能为合作伙伴提供合理的测序深度建议。

定向测序

1. 迪奥生物设计的实验方案可以实现PCR产物的定向测序。

2. 定向测序技术避免了非定向测序造成的数据冗余，充分利用了每条有效测序序列，且便于后期的菌群分类处理。

3. 定向测序能为合作伙伴节省454文以来构建的费用。

4. 扩增引物的合成质量是定向测序成败的关键。

1. 数据统计分析

1） 有效测序数据统计

2） 可借精准分析的数据产量统计

2. 数据回归样品

1） 根据tag信息将测序数据回归各自样品

3. 单样品微生物种类及丰度分析

1） 序列聚类OUT（Operational Taxonomic Units）

2） 取样深度判定（Rarefaction Curve）

3） 计算菌群我样性和丰度指数

4） 单样品群落结构分析一饼图

实验周期

1. 环境样品

1） 严格按照采样标准采样。

2） 采样后务必立即封存样品冷冻保存。

3） 样品保存期间切记反复冻融。

4） 送样时使用干冰运输。

5） 请填写完整的送样订单，用自封袋密封后随同样品一起送样。

2. 环境样品DNA

1）请提供OD值介于1.8-2.0之间，浓度>10ng/ul,总量>200ng的DNA,并确保DNA无降解。

2）送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

3）样品保存期间切记反复冻融。

4）送样时使用干冰运输。

5）请填写完整的送样订单，并提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。

   3.PCR产物

   1）请按照迪奥生物提供的引物设计要求进行PCR实验。

   2）PCR产物浓度>10ng/ul.总量>200ng,OD260/280在1.8左右。

   3）PCR产物需经电泳切胶回收纯化。

   4）送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

   5）样品保存期间切记反复冻融。

   6）送样时使用干冰运输。

   7）请填写完整的送样订单，并提供PCR产物纯化前后的电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。