一、免疫组化染色实验原理及步骤 实验原理 抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。 免疫组化染色实验步骤 1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗； 2.抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min； 3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入0.3%甲醇过氧化氢溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min； 4.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h； 5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）； 6. 加生物素二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加生物素偶联的二抗，覆盖组织，室温孵育 50min； 7.加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，覆盖组织，室温孵育 50min；之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min； 8. DAB 显色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色， 自来水冲洗切片终止显色； 9. 复染细胞核：Harris 苏木素复染 3min 左右，自来水洗，分化液分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝； 10. 脱水封片：将切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片； 11. 显微镜镜检，图像采集分析。 二、染色结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的阳性表达为棕黄色。