单克隆稳定细胞株构建实例（TALEN技术）

摘要：本实验使用识别并切割AAVS1位点的TALENs质粒与带有同源臂的模板质粒共转，利用同源重组修复机制将模板质粒同源臂中间的表达框（CMV-EGFP-IRES-Puro-poly A）定点整合到293T细胞的19号染色体的AAVS1位点。再通过单克隆挑选技术获得同时稳定表达EGFP和Puromycin抗性基因的细胞株。该稳定细胞株可以通过cre/loxp技术高效地整合其它外源基因。
关键词：AAVS1，单克隆定点整合稳定细胞株， 293T，TALENs

一、 实验原理
传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。同时，获得稳定株中外源基因整合的位置不确定，对于后续的研究容易造成干扰。利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了虽然传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。但是获得的混合稳定株同样整合位点随机。而利用TALEN技术的定点整合技术可以将外源基因定点整合到公认的安全位点AAVS1，可以为基因功能的研究打下良好的基础。

二、 实验目的
通过TALEN技术结合单克隆挑选获得同时稳定表达EGFP和Puromycin抗性基因的293T细胞株。

三、 实验步骤
1. 细胞铺板：
将293T细胞按70%的融合度接种到6孔板。
2. 质粒转染：
16h后按照转染试剂说明书转染细胞（4μg混合质粒pTALEN-AAVS1-F，pTALEN-AAVS1-R，定点整合模板质粒（1:1:1），10μl和元生物转染试剂）。
3. 稳定株筛选：
1) 72h以后，加入终浓度2μg/ml puromycin。每隔2-3天换一次终浓度2μg/ml puromycin的新鲜培养基。
2) 3-4天后，消化为单细胞，有限稀释法将细胞铺于96孔板。
3) 挑选有荧光的细胞单克隆继续扩增后冻存。
4) 提取基因组DNA，PCR产物测序。

四、 实验结果

                                                          图1. 测序结果比对图

 结果：从图1的测序结果比对可以看到，CMV-EGFP-IRES-Puro-polyA表达框已经成功整合到AAVS1位点。

五、 参考文献
1. Holkers M, Maggio I, Liu J, et al.,Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells.Nucleic Acids Res. 2013 ;5:e63.