焦磷酸测序（Pyrosequencing）首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一用生物素标记。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。 Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。 测序反应是这样进行的：在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如该dNTP与模扳配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。掺入的 dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。 随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。
　　焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术可以给出启动子一段区域绝对的测序结果和甲基化程度的精确比率，可以说是甲基化检测的金标准，是甲基化精 确定量的检测平台，它不仅能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至还包括测序的引物区域。

优势

• 单一位点的质量评估和序列信息
• 分析含有CpG位点的SNP
•  序列信息中不同位点的频率计算
• 适用于新鲜冷冻，和石蜡包埋的样本
• 不同的应用实验可同时在一次运行中实现