产品描述

本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20 min。操作过程省去冰浴、热激和1 h复苏。4）可连接长达5 kb目的产物；5）Hieff Clone^TM Topo-blunt simple vector不含多克隆酶切位点（MCS），使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。

产品用途

平端PCR产物的克隆。

克隆后PCR产物的快速测序（使用M13F/M13R引物）。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C保存，避免反复冻融。有效期一年。

注意事项

1）pESI-Blunt simple vector (30 ng/ul) 插入位点两端不含多克隆酶切位点，需要在PCR设计引物时引入合适酶切位点。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、Control DNA 片段的克隆实验

1）在无菌微量离心管中配制下列DNA溶液，以10 μL为例。

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5 min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5 min，一般1-2 min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）连接产物可直接转化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL连接液，加入50 μL感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

b）通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5 min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振荡培养10 min。

6）取200 μL菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100 μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

二、 一般DNA片段的克隆实验

所插入片段为平末端产物，利用高保真酶（如Canace高保真酶，Yeasen Cat#10135）扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

【注】：a、PCR产物不能磷酸化。

       b、如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1）按照下表配制连接体系（以10μL为例）

【注】：a）可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

b）不同的插入片段所用量参考下表：

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5 min。

【注】：连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）全量10 μL加入100 μL感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5 min。

【注】：a）也可取5 μL连接液，加入50 μL感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

b）通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5 min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。