浓度：5U/ul

货号：GWP100

有效期：24个月

保存条件：-20℃

产品简介：

GsmartI pfu DNA Polymerase适用于对PCR产物保真性要求高的实验，即便使用困难模板该酶也能精确快速的进行PCR扩增。GsmartI pfu DNA Polymerase的高保真性使其成为克隆的最佳选择。该酶具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，3-5外切酶活性可以在聚合反应中纠正错误参入的碱基，使其具有较高的保真性，该酶不仅适合扩增端片段序列也适合扩增长片段序列，该酶PCR扩增产物为平末端，可以直接进行平末端克隆。

主要应用：

• 高保真PCR扩增
• 扩增DN**段用于基因表达克隆
• 扩增DN**段可用于平末端连接
• 基因定点突变

​扩增能力：

• 延伸速度为2kb/min
• 简单模板，如以λDNA为模板，可以有效扩增不超过12kb片段（≤12kb）
• 复杂模板，如以人基因组为模板，可以游侠扩增不超过3kb片段（≤3kb）

活性单位定义：

用活化的大马哈鱼精子DNA做模板，74℃ 30min内摄入10nmol全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为一个活性单位，即1U。

注意事项：

• 推荐退火温度为引物Tm值－5℃；
• 延伸速度1-2kb/min；
• 50ul体系中GsmartI Pfu DNA Polymerase的用量为2.5 U；
• 使用dNTP，dUTP将导致PCR失败；
• GsmartI Pfu DNA Polymerase产生平末端DNA产物；

使用指导：

使用GsmartI Pfu DNA Polymerase的操作步骤建议：

打开前所有管子都需要轻轻混匀和离心以保证溶液的均一性和利用率，PCR反应液应放置于冰上配制。如果扩增多个样本，可以配制反应mix，最后加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

1. 反应体系：

✲推荐的引物终浓度为0.2uM，但可以根据需要在0.1-0.5uM范围内变化。

​2. 将反应管上下颠倒混匀数次，尽量避免产生气泡，最后使用微型离心机离心

3. PCR反应程序：

备注：

       建议以引物的Tm-5℃作为退火温度；

       延伸速度以1-2kb/min计算

反应混合物的组分：

• 酶：酶的最佳用量取决于模板量和PCR产物的长度。一般50ul反应体系中用2.5U的GsmartI Pfu DNA Polymerase就能得到较好的结果；对于某些PCR，可以适当增加酶的用量，但是不要超过5U/50ul体系建议最后一步加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

• Buffers：提供10x Pfu Buffer

• dNTP：GsmartI Pfu DNA Polymerase扩增需要高质量的dNTP ，4种dNTP中每种最佳浓度为100uM. GsmartI Pfu DNA Polymerase不能识别dUTP、dITP或其衍生物，故不能使用包含dUTP、dITP及其类似物的模板和引物。

• 模板：50ul 反应体系中，低复杂度的模板DNA（比如质粒、λDNA和BAC DNA等）用量1pg-100ng；高复杂度的基因组DNA模板用量为50-250ng，如果cDNA合成反应混合液，模板体积不要超过PCR总反应体积的1/10.

• DMSO（可选）：对于高GC模板，推荐的DMSO终浓度为3%；DMSO也可以用于超螺旋质粒的解旋和变性。如果反应体系中添加高浓度的DMSO，要降低退火温度，因为DMSO会影响引物的熔点。据报道10%DMSO可以使退火温度降低5.5-6.0℃.

反应条件建议：

• 起始变性温度：变性温度为95℃，由于GsmartI Pfu DNA Polymerase具有较高的热稳定性，可以使用更高的变性温度。95℃起始变性温度下变性时间推荐使用4min，有些模板推荐使用更长的变性时间，变性时间可以延伸至5min.

• 变性温度：对大多数模板来说，94℃下变性30s已经足够

• 引物退火：引物Tm－5℃退火10-30s；

• 延伸：延伸在72℃下进行，延伸时间依赖于扩增子的程度和复杂度，对于低复杂度的基因组DNA，延伸速度为15-30s/kb；对于高难度的基因组DNA延伸速度为30-60s/kb；对于cDNA模板，若想获得比较理想的结果，延伸速度为30-60s/kb.

引物设计建议：

• 引物长度一般为16-30bp
• 引物3’端最后一个碱基最好是G或C
• 引物3’端最后几个碱基避免出现连续错配
• 引物3’端避免有发夹结构或碱基修饰，
• 如扩增编码区，引物3’端不要终止于密码子的第3位，以免影响扩增特异性和效率
• 正向引物和反引物的Tm值不要相差太大，Tm值尽量控制在55-65℃
• 引物的GC含量尽量控制在40%-60%之间
• 引物A、T、C、G应均匀分布，避免使用GC或TA含量高的区域

可能会遇到的问题及解决办法：

1. 无扩增产物或扩增效率低

2. 出现非特异性扩增或smear带：

Gsmartl Pfu DNA Polymerase.pdf