G5热启动超保真PCR Mix

描述：G5 超保真 DNA 聚合酶来源于高保真 Pfu DNA 聚合 酶，具有很强的 3’-5’外切酶活性。经基因工程改造后，使具 有 100 倍于 Taq DNA 聚合酶的保真能力，除此外其还具有 6kb/min 的延伸速度。扩增能力强、保真性高。可用于载体 构建、突变修复、基因合成、DNA 测序等高保真要求较高的 试验。该酶的扩增产物为平端产物，不含“A”尾。以 λDNA 为模板扩增 20kb 基因片段，以人基因组为模板扩增 12kb 的基因片段。 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix 是经优化的即用型 PCR 预混物，含有经抗体封闭的热启动 G5 超保真 DNA 聚合酶、 dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂和稳定剂，使用 时只需加入模板、引物和灭菌水即可进行 PCR 扩增，大大 简化了操作过程、提高了效率、减少了 PCR 操作过程中的 人为误差。具有快速简便、重复性高、特异性好、灵敏度高 和稳定性好的特点。该制品中已经含有溴酚蓝染料，PCR 扩增完毕后可直接点样于琼脂糖凝胶，无需再加入 DNA Loading Buffer。 组分： 40TX50μl 200TX50μl 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 0.4 ml 0.4 ml × 5 储存：长期储存置于-20°C 以下，可保存 3 年；短期使用置 于 4°C（12 个月）保存。 2XTaq PC 使用方法 1. 室温融解 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye)。 2. 按下表配制反应体系并混合均匀： 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 10 μl 上游引物(10 μM) 2 μl 下游引物(10 μM) 2 μl 模板 DNA 1-500 ng ddH2O up to 50 μl *模板 DNA 用量参数(50 μl 反应体系) 25-250 ng Genomic DNA 1-10 ng Plasmid DNA 1-2 μl cDNA from RT reaction 3. PCR 扩增循环参数 循环数 温度 时间 1 st Cycle 95°C 2min 25-35Cycles 95°C 10s 55~68°C 20s 72°C 2kb/min Last Cycle 72°C 5min （1） 在以质粒为模板的情况下，可按照 5kb/min 设置延 伸时间，在以基因组 DNA 和 cDNA 为模板条件下， 可按照 2kb/min 设置延伸时间。 （2） 以 G5 PCR Mix 进行 PCR 反应时引物长度通常在 18~23bp 为宜，GC 含量 40~60%为最佳。GC 含量 超过 65%以上的模板建议使用 5XQ Solution 。 （3） 由于 G5 DNA 聚合酶具有较强的引物模板结合能 力，通常情况下 TM 值较 Taq DNA 聚合酶高 3~5°C。 因此，退火温度可提高 3~5°C。 4.琼脂糖凝胶电泳：直接取 5 μl 扩增产物进行电泳检测。

G5 超保真DNA聚合酶(性能等同于NEB Q5超保真DNA聚合酶)来源于高保真Pfu DNA聚合酶，具有很强的3’-5’外切酶活性。经基因工程改造后，其具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力，此外其还具有6kb/min的延伸速度。扩增能力强、保真性高，可用于载体构建、突变修复、基因合成、DNA测序等对保真性能要求较高的试验。该酶的扩增产物为平端产物，不含“A”尾。该酶以λDNA为模板扩增20kb基因片段，以人基因组为模板扩增12kb的基因片段。 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix（性能等同于NEB Q5热启动超保真PCR Mix）是经优化的即用型PCR预混物，含有经抗体封闭的热启动G5 超保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂，使用时只需加入模板、引物和灭菌水即可进行PCR扩增，大大简化了操作过程、提高了效率、减少了PCR操作过程中的人为误差。具有快速简便、重复性高、特异性好、灵敏度高和稳定性好的特点。该制品中已经含有溴酚蓝染料，PCR扩增完毕后可直接点样于琼脂糖凝胶，无需再加入DNA Loading Buffer。

组份

名称 40T(50μl体系) 200T(50μl体系) 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 0.4 ml 0.4 ml x5

主要特征

具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力。 顶级的扩增速度，在目的条带≤2kb时扩增速度可达4kb/min以上。 具有良好的模板兼容性，对于基因组、质粒、cDNA、λDNA模板都有良好的扩增。 优异的长片段扩增能力，以λDNA为模板可扩增20kb产物。 良好的扩增灵敏度，人基因模板低至1ng也可以有效扩增。

应用

基因合成、突变修复和平端克隆。

储存

长期储存置于-20°C以下，可保存2年，避免反复冻融；短期使用置于4°C（3个月）保存，一经融化后请放置于4°C，勿再冻存。

实例

1. 良好的模板兼容性和长片段扩增

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix以 Gdna(A)、λDNA(B)、Hela Cdna(C)为模板扩增不同靶基因，结果显示5XHotStart HiFi G5 PCR Mix具有优异的长片段扩增能力，基因组可达12kb以上、λDNA可达20kb以上、Hela cDNA可扩增至7.6kb以上。 A: 1~5 分别为以gDNA为模板扩增的500bp、2kb、5kb、8kb、12kb PCR产物； B: 1~7 分别为以λDNA为模板扩增的 500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb PCR产物； C：1~8分别为以cDNA为模板扩增的166bp、552bp、960bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp、7600bp PCR产物。M:Marker 10000。

基因名称 模板使用量 gDNA：500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng 2kb~8kb 100ng ＞8kb 200ng λDNA：500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng Hela cDNA：166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相当mRNA 50ng ＞2kb 相当mRNA 200ng

≤2kb 2~8 kb ≥ 8 kb 95°C，2min 95°C，2min 95°C，2min 95°C，20s 58°C，20s 72°C，30s32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C， 2kb/min 32cycles 95°C，20s 58°C，20s 72°C， 1kb/min 32cycles 72°C，2min 72°C，2min 72°C，2min

2.不同延伸速度对于扩增的影响

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix，以gDNA为模板扩增2259bp（A）和4564bp（B）目的片段，分别用不同的延伸时间，结果表明当目的片段长度≤2259 bp时G5 PCR Mix的延伸速度在4kb/min以上，而片段长度≥4564bp时延伸速度为2kb/min。A图1-4延伸时间分别为10s、30s、1min、2min，B图5-8同A图1-4；M: DNA Marker 10000。

3. 扩增灵敏度测试

使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix，以gDNA为模板扩增2259bp目的片段，设置不同的模板梯度，结果表明基因模板低至1ng 时G5 PCR Mix也可以有效扩增。图中1-10模板量分别为0.5ng、1ng、5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng、0.5μg、1μg；M: DNA Marker 10000。

常见问题及解决方案：

无扩增或产量低 循环数 退火温度 模板DNA纯度和用量 延伸时间 引物用量 引物设计 增加循环数至35~40cycles 以2℃为单位降低退火温度 使用高纯度的模板DNA，使用合适的模板量。 延伸时间按1 kb/min设置 在0.1μM~0.5μM之间选取合适的引物量 重新设计优化引物 出现杂带或Smear 退火温度 引物浓度 循环数 模板DNA使用量 引物 以2℃为单位提高退火温度 降低引物浓度至0.2μM 降低循环数至25~28cycles 使用合适的模板量，不要过多使用 重新设计优化引物

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！