性能

将检测和定量基因突变整合入一个强有力的体系，使用焦磷酸测序技术，相较于其他基于测序的方案在分析靶向短链DNA序列时，PyroMark平台表现更卓越。在表观遗传学研究中分析甲基化状态，焦磷酸测序技术可高重复性的定量甲基化频率，包括单个或连续的CpG位点，并可检测和定量甲基化水平的微小变化。

对于遗传检测应用，焦磷酸测序技术可准确定量等位基因的可变位点，且很容易解决杂合性问题。 对于微生物鉴定和抗性分型，焦磷酸测序技术能够同时分析多个样本的常见的药物抗性突变的。

原理

焦磷酸测序技术基于边合成边测序的原理，数分钟内可获得定量数据。PyroMark Q96 ID是提供实时序列信息的完整体系，高度适用于检测遗传变异、遗传定量和短链DNA测序。以下的产品可配合PyroMark Q96 ID仪器使用：PyroMark Q96 Vacuum Workstation、PyroMark CpG SW、PyroMark Assay Design SW、PyroMark IdentiFire SW、PyroMark Gold Q96 Reagents和PyroMark Control Oligo。同时提供样本制备方案，可使用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制备单链DNA。

焦磷酸测序反应步骤：

步骤1：扩增DNA片段，作为焦磷酸测序模板的单链是生物素标记的。变性后，分离生物素标记的单链PCR扩增子，与测序引物杂交。杂交的引物和单链模板同各种酶一起孵育，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和荧光素。

步骤2：第一个脱氧核苷三磷酸（dNTP）加入反应中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP结合到DNA链上与其互补的碱基位。每次结合都会释放与核苷酸相等摩尔量的焦磷酸（PPi）。

步骤3：在有APS的条件下，ATP硫酸化酶将PPi转化为ATP。在这个ATP的驱动下，荧光素酶将荧光素转化为氧化荧光素，并产生可见光，可见光的量与ATP的量成正比。通过电荷耦合（CCD）相机即可检测到荧光素酶催化反应产生的可见光，并在原始数据输出（Pyrogram）中显示为一个峰，每个峰的高度（光信号）与结合的核苷酸数量成正比。

步骤4：三磷酸腺苷双磷酸酶，是一种核苷酸降解酶，会降解未结合的核苷酸与ATP。完全降解后，加入另一个核苷酸。

步骤5：持续添加dNTP。α-硫代脱氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反应中用于替代天然脱氧腺苷三磷酸（dATP），这是因为DNA聚合酶可高效的应用前者，而不被荧光素酶识别。当该过程连续进行时，就会形成互补的DNA链，可根据Pyrogram追踪的信号峰确定核苷酸序列。

简化的工作流程—从样本到结果

多功能PyroMark Q96 ID与表观遗传和遗传分析流程无缝接合，且与QIAGEN先进的样本制备、亚硫酸氢盐转化和PCR扩增技术兼容。借助于高度可靠的仪器可在序列水平上对SNP、插入和缺失、CpG位点的检测以及生成序列信息。简化的工作流程可更快速地获得结果。

快速方便的样本制备

从PCR产物到直接用于测序的单链模板，应用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分钟内同时制备96个样本。该工作站操作简单，且手工操作时间少于5分钟。

流程

快速方便的样本制备

从PCR产物到直接用于测序的单链模板，应用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分钟内同时制备96个样本。该工作站操作简单，且手工操作时间少于5分钟。

在焦磷酸测序之前，形成了一个生物素标记的PCR产物，该产物结合到覆盖链酶亲和素的琼脂糖凝胶珠上。这些胶珠会被真空仪器捕捉并彻底清洗，随后变性，得到适合于焦磷酸测序的单链DNA。该模板DNA放入含测序引物的焦磷酸测序反应板中，随后引物退火，再将该板放入PyroMark仪器中即可。PyroMark Gold试剂包含用于焦磷酸测序反应的酶、核苷酸和底物，将这些试剂移入分配卡夹，按照软件中提供的体积试被加入仪器中，用于焦磷酸测序。

应用

焦磷酸测序技术对各个领域的研究应用至关重要。PyroMark Q96 ID能够灵敏的分析遗传学和表观遗传学的变化，如检测病原体中药物抗性的发展，基因表达调控中表观遗传学DNA甲基化的作用、牲畜的特异表型的遗传标记，以及法医检材样本中线粒体DNA的多态性。此外，由于焦磷酸测序技术整合了序列检测和定量，提高了分析灵敏度，有助于发现新的信息。

软件

易于使用的PyroMark Q96软件

PyroMark Q96软件能够全面分析您的结果。最近更新的软件包含四个分析程序：AQ（等位基因定量）、SNP（分析SNP和InDel）、CpG（甲基化分析）和SQA（序列鉴定）。这四个不同类型的程序可在同一块板上同时分析样本。

使用PyroMark Assay Design Software，灵活、简单的设计焦磷酸测序实验

PyroMark Assay Design Software 2.0实现轻松的PCR和测序引物的设计。这些产品是经过优化的，可用于所有的PyroMark仪器。