细胞生物学技术服务

本公司为您提供最优质的细胞生物学技术服务，主要包括稳转细胞株的构建、原代细胞分离、细胞增殖与毒性实验、细胞周期及凋亡检测及其他各种细胞功能学实验。

细胞培养及筛选

细胞培养又称细胞克隆技术，是进行所有后续细胞功能学实验的基础，而且通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。很多生物产品都是从细胞得来，因此，细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

原代细胞的分离及培养

人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm³的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
1. 悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞。
2. 实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。
1）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。
2）消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
原代细胞保持原有细胞的基本性质，是研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，为传代培养创造条件并且能用于药物筛选等。

小鼠肝实质细胞

大鼠心肌细胞

稳转细胞株的构建

外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天，而后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因，稳转细胞系的构建即为后者。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。

稳定表达细胞株在细胞中能持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳定表达细胞株弥补了瞬时感染（或转染）一些功能实验中由于外源基因表达时间短的缺陷，便于长期观察基因对于细胞功能的影响以及蛋白间相互作用。

神经元细胞（慢病毒感染后5d）

SP1/0细胞（慢病毒感染后48hr）

细胞增殖与毒性

CCK-8检测

实验原理
Cell Counting Kit简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）的广泛用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8在电子耦合试剂存在的情况下可以被线粒体内的脱氢酶还原成高度水溶性的黄色甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

技术应用
CCK-8用途非常广泛，适合于高通量药物筛选，应用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

实验流程

实验结果

CKK-8检测HO-8910PM细胞增殖抑制结构统计图

MTS细胞增殖实验

实验原理
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞 毒实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS(a)] 和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate; PES)。PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳 定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代CellTiter 96®AQueous Assay的基础上的改进，CellTiter 96®AQueous Assay中使用的电子偶联剂PMS与MTS溶液是分开提供的。
MTS (Owen’s reagent) 被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中。 这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。检测时，只需将少量的CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent 直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，然后以酶标仪读取490nm的吸光度值。

MTS四唑盐和其甲臜产物的结构

实验流程
将试剂平衡至室温，每100ul培养基中加入20ul CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent，37℃孵育1-4小时，酶标仪490nm读取吸光值。

实验结果

CellTiter 96® AQueous One Solution Assay检测490nm处细胞数对吸光值的影响

MTT检测

实验原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

技术应用
MTT法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测，大规模抗肿瘤药物的筛选，细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等。

实验流程

实验结果

Flutamide（FLU） 和CI-1040对肿瘤细胞活性的影响
（A）5～30μM浓度范围的FLU作用于MDA-MB-453细胞MTT检测结果（B）2～25μM 浓度范围的CI-1040作用于MDA-MB-453细胞MTT检测结果

细胞周期与凋亡检测

流式细胞术检测细胞凋亡

实验原理
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布于细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂质膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种广泛分布于真核细胞胞浆的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，故可结合凋亡早期细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸。常用荧光探针FITC标记Annexin V，通过流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以定量检测处于的不同凋亡时期细胞。

技术应用
细胞凋亡一直是人们研究的热点，细胞凋亡与临床病毒有密切的关系，这种关系不仅表现在凋亡及其机制的研究，阐明了一大类免疫病的发病机制，而且由此可以导致疾病新疗法的出现，通过检测药物、基因、或蛋白对细胞凋亡机凋亡调控基因的影响，研究肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫疾病、心肌梗塞等疾病的疗法。

实验流程

实验结果

B3作用于MCF-7细胞流式细胞仪凋亡检测分析

流式细胞术检测细胞周期

实验原理
细胞周期是细胞生命活动中一个最重要的过程，细胞增殖的过程称为细胞周期。在细胞周期中，最主要的是遗传信息的载体DNA复制成两份拷贝，并通过有丝分裂的方式将两份拷贝分配到两个子细胞内，由此，细胞周期分为DNA合成期（S期）和有丝分裂期（M期），M期结束后和S期开始前的间隙期称为G1期，S期结束后和M期开始前的间隙称为G2期。每一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束，构成一个完整的细胞周期。正常细胞在G1期具有二倍体细胞的DNA含量（2N），G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞仪检测PI的荧光强度就可以直接反映出细胞内DNA含量。将细胞周期各时相区分为G0/G1期，S期和G2/M期，通过相关软件进行积分便可计算出各时相的百分率。

技术应用
利用流式细胞仪进行细胞周期和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断；检测药物、蛋白、基因对细胞周期的影响。

实验流程

实验结果

流式细胞仪检测细胞周期结果图

细胞功能学实验

细胞侵袭和迁移实验

实验原理
细胞迁移，指的是细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。移动过程中，细胞不断重复着向前方伸出突触/伪足，然后牵拉后方胞体的循环过程。细胞骨架和其结合蛋白，还有细胞间质是这个过程的物质基础，另外还有多种物质会对之进行精密调。细胞体外迁移实验通常用transwell实验。常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
细胞侵袭主要指恶性细胞从原组织脱离，侵犯到临近正常组织的过程。铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。

技术应用
细胞迁移，涉及细胞觅食、伤口痊愈、胚胎发生、免疫反应、感染和癌症转移等等生理现象，是目前细胞生物学研究的一个主要课题，科学家们试图通过对细胞迁移的研究，在阻止癌症转移、异体植皮等医学应用方面取得更大成果。细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究。

实验流程

实验结果

细胞迁移实验

免疫荧光实验

实验原理
细胞免疫化学与免疫组织化学实验都是依据抗原抗体反应和化学显色的原理，采用标记的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布进行原位检测技术。免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬片、固定、破膜、封闭后，加入一抗与抗原蛋白结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。

技术应用
免疫荧光实验可以特异性地检测靶蛋白在细胞内的表达和定位。

实验流程
细胞培养---加药处理---细胞爬片----细胞固定、封闭----抗体孵育----荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测---图片采集、处理

实验结果

细胞免疫荧光实验结果图

Western blot检测

实验原理
Western Blot，即蛋白质印迹法，又称为免疫印迹法，是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

技术应用
Western Blot法应用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学，可对目标蛋白进行定性和半定量的分析；对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴定和定量；还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。

实验流程

实验结果

KLT对异种移植瘤PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响

TALEN技术

实验原理
TALE (Transcription Activator-Like Effector) 是由植物致病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该种蛋白通过其内部保守的重复氨基酸序列（即DNA结合域）与植物宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异性结合，并激活基因表达。
TALE的DNA结合域由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块一般包含33~35个氨基酸（aa），其第12,13位氨基酸种类可变且决定了TALE与DNA结合的特异性。因此称这种重复可变的双氨基酸序列为RVD (Repeat Variable Diresidue)。
TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。
TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂（DSB，Double-Strand Breaks），从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。