T4 RNA 连接酶 2 （截短型 K227Q）

产品及特点

T4 RNA 连接酶 2（截短型 K227Q），又称T4 Rnl2tr K227Q， 可特异地将5 末端预腺苷化的DNA或RNA连接到RNA 3 OH 末端。该酶连接时不需要ATP，但需要预腺苷化的接头。T4 Rnl2tr K227Q 是 T4RNA 连接酶 2 截短型 的点突变体，K227 的突变减少了酶、赖氨酰及腺苷复合物的形成，也降低了非特异性的连接产物(多连体和环状体) ，后者可能是通过降低该酶从接头向RNA5磷酸基转运腺苷基团的微量活性而实现的。 该酶在连接反应中，无需 ATP，利用预腺苷化的接头和降低的酶-赖氨酰腺苷化活性能将连接背景降为最低。此酶已被用于 microRNA 克隆中接头的优化连接。

1. 将预腺苷化的 DNA 或 RNA 序列标签连接到任何 RNA 3 末端

2. 将单链腺苷化引物连接至小 RNA 上，用于 cDNA 克隆文库构建

3. 将单链腺苷化引物连接至 RNA 上，用于链特异 cDNA 文库构建

4. 无单链和双链 DNA 核酸外切酶、核酸内切酶、RNase 以及磷酸酶的污染。

反应条件

1X T4 RNA 连接酶反应缓冲液 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25℃) ，10 mM

MgCl2，1 mM DTT]，25℃ 温育。

随酶提供试剂

单位定义

200 单位指 10 μl 反应体系中，25℃ 条件下，1 小时将 80% 的 31-mer RNA连接到预腺苷化 17-mer DNA 末端 [通用 miRNA 克隆接头] 所需的酶量。5´-FAM- rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUrCrArGrCrArArUrA-3´5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´

Buffer成分

10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，0.1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50%Glycerol，pH 7.5 @ 25℃

热失活

65℃ 加热 20 分钟。

参考文献

(1) Ho, C.K. et al.（2004）Structure, 12, 327–339.

(2) Ho, C.K. and Shuman, S. （2002） Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 99,12709–12714.

(3) Nandakumar, J. et al. （2004） J. Biol. Chem., 279, 31337–31347

(4) Pfeffer, S. et al. （2005） Nat. Meth., 2, 269–276.

(5) Chen, P.Y. et al. （2005） Genes and Dev., 19, 1288–1293.

(6) Aravin, A. and Tuschi, T. （2005） FEBS Letters, 579, 5830–5840.