双荧光素酶报告基因检测服务 
 
双荧光素酶报告基因法（luciferase Assay）检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用
 
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：
（1）       构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）       将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）       加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

实验步骤：
（1）       用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）       设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）       筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4）       扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5）       培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6）       将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）       提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8）       加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9）       计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

细胞信号转导研究的利器——双荧光素酶报告基因检测

信号转导检测
细胞信号转导的调节（抑制或增强）
目的蛋白对已知蛋白的调控
启动子/增强子检测
病毒/细胞相互作用
转录因子(IFN  -NF-KB,IRF3)
药物诱导作用或效果
各种射线处理对细胞因子的调控研究


传统检测方法——WB
SCI文章必备数据（IF>3,调节功能研究）。
Western blotting 得到结果所需时间太久.
操作过程繁琐，并且需要使用比较昂贵的抗体.
WB结果缺乏统计学依据。
人为影响因素太大

荧光素酶报告基因的优点
优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上。
具有可靠的统计学原理，每组实验重复三次。
高信号值，无内源活性。
目前主流检测方法。
检测快，灵敏度高。
我们并不放弃WB检测，在荧光素酶检测后，样品在进行WB检测，使实验更具有说服力。
使用范围广，可检测细胞内任何分子。

荧光素酶报告基因的检测原理
原理：制备含有Luc/Rluc的DNA载体，进行过表达细胞株。

细胞选择：根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T,Hela细胞及原代细胞等。

转染：将带有荧光素酶标记的报告基因和目的基因进行过表达 (不同时间点) .

提供刺激：一般为药物处理，病毒感染，紫外照射等各种条件刺激。

蛋白收集：采用进口/国产试剂盒（Promega，invitrigen，尚柏生物）进行收集，实验重复三次。

测量荧光：Modulus™ 单管型多功能荧光计 进行检测。

结果分析




服务内容：
1.我们提供IFN-Luc，IFN-Luc，ISRE-Luc，PRDII-Luc，ERSE-Luc，UPRE-Luc，NF-KB-Luc双荧光素标记的报告基因，可对IFN-α, IFN- β, IRF3, NF-KB等通路检测。
2.我们提供常见表达细胞：293T,Hela及常见的原代细胞等。
3.客户只需根据实验需要提供目的基因、荧光素标记的报告基因、表达细胞即可。
4.我们提供真实的原始数据，结果分析报告。