基因表达标签测序技术

基因表达标签测序（Tag profiling）技术是基于Illumina高通量测序平台的全基因组表达谱研究技术，其原理是使用每个转录本3’端一段特定的21bp标签序列来表征相应转录本的表达水平，利用Illumina高通量测序技术获得测序文库中所有标签的序列信息，进一步通过生物信息学分析比对，鉴定这些标签序列所代表的基因，以及根据相同标签序列出现的频率计算该基因的表达水平，同时还能够比较不同样品间这些基因表达水平存在的差异。相对于传统的基于杂交技术的基因芯片分析平台，基因表达标签测序能够提供更加精确的数字化信号，更高的基因表达数据检测通量以及更广的检测范围。同时，由于不需要预先针对已知序列设计探针，它能够直接用于任何物种的全基因组表达谱分析，在检测未知转录本，稀有转录本以及反义转录本等方面具有无可比拟的优势。

技术优势

数字化信号：基于高通量测序技术的表达谱分析，直接测定每个转录本标签序列，通过标签序列计数来确定基因表达量，极大地提高了定量分析的精确度。不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，因此样品间细微的表达差异也能够被检测出来。

高灵敏度：一般认为，单个细胞中的转录本数量是35万个，而一个通道测序至少产生400万有效标签数，这意味着即使是单拷贝的稀有转录本，在一次实验中也能平均被测到12次，非常利于检测低丰度转录本。

任意物种的全基因组分析：不需要预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行全基因组表达谱分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本。所得到的数据能够使用现有的基因组数据库注释，当现有数据库更新后，只需对原始数据进行重新注释即可进行新的分析。

高质量数据，无需重复：数字表达谱产生的数据与实时定量PCR的结果具有高度的一致性。

上图：基因标签测序与Real-Time PCR具有高度一致性的结果

更大的动态检测范围：传统基因芯片检测的线性范围在4-5个数量级，而表达标签测序技术的检测范围则能达到6个数量级以上，更加真实的反映样品中所有转录本的表达水平。

更丰富的生物信息分析：除了能够提供不同样本间基因表达差异信息，数字化表达谱分析能够区分转录方向相反的反义转录本，以及新的转录本，更有助于进行重要的科学发现。

应用领域：

任意物种基因表达谱分析，新转录本与稀有转录本检测，反义转录本检测

康成生物提供的基因表达标签测序服务流程：

1. 样品RNA准备

2. 测序文库构建

使用oligo dT微珠纯化mRNA

反转录反应合成合成双链cDNA

使用特定测序接头Gex Adapter 1连接5’端

使用标签酶MmeI消化获得21bp标签序列

使用特定测序接头Gex Adapter 2连接3’端

高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库

3. DNA成簇（Cluster）扩增

4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）

5. 数据分析

原始数据读取

对标签序列进行注释，标注其对应基因

对标签序列计数统计，得到其对应基因的表达量信息

深层次数据分析

6. 提供实验报告

原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估。

基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息、正负链信息、相应序列表达水平统计等。

高级数据分析（应客户要求定制），如差异表达基因鉴定及功能分析，新转录本鉴定等。

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