TALEN靶向基因敲除

TALEN（Transcription activator -like effectors）是一种源于植物致病菌Xanthomonas的崭新的靶向基因操作技术。研究证明TALE蛋白的氨基酸序列与靶位点的核酸序列具有恒定的对应关系，一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。研究者通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。

TALEN应用：

1.基因敲除（konckout）

2.基因敲入（knockin），包括条件性基因敲入

3.建立基因打靶的真核生物的细胞系

4.构建基因打靶的生物模型

　　技术特点：

　　·无基因序列、细胞、物种限制。
　　·实验周期短。
　　·整个实验简单准确，成本低。
　　·成功率可达90%以上。
　　·毒性低、脱靶情况少。
　　·TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
　　·靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。
　　·成对的TAL识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。
　　·已经成功应用到了植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。

服务目录

　　 基本原理与基因敲除步骤

步骤一 TAL靶点识别模块构建

TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸。双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确。因此，欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元串联克隆即可。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TAL识别模块构建。

　　步骤二 将（两个相邻）靶点识别模块（分别）克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对

靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。

　　步骤三 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除

TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。诱发DNA损伤修复机制。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生错误的个体即形成目标基因敲除突变体。

　　步骤四 目标基因敲除突变体筛选确证

利用实验设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，可进行PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。