抗氧化/自由基检测

     本检测指标包括总谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG)、活性氧ROS、丙二醛MDA、TAC总抗氧化能力、超氧化物歧化酶SOD、CuZn+Mn-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢H2O2、过氧化氢酶等检测。

谷胱甘肽 (GSSG+ GSH)检测基本原理：通过谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来后，总谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定A412就可以计算出总谷胱甘肽的量。还原型谷胱甘肽是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂，总谷胱甘肽中通常90-95%为还原型谷胱甘肽。

活性氧ROS利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧的检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

丙二醛MDA (Malondialdehyde)是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。通过比色法对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，血浆、血清样品中的MDA含量通常在约2-4µM，尿液中的MDA含量通常在约1-2µM。

TAC总抗氧化能力，抗氧化剂在阻止自由基的形成和自由基清除以及其他潜在的毒性氧化物中有重要作用。抗氧化剂有三种类型：酶系统（GSH还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等）、小分子（抗坏血酸、GSH、维生素E等）和蛋白（白蛋白、转铁蛋白等）。不同的抗氧化剂其还原力不同。Trolox用作抗氧化剂的标准，以相当于Trolox的抗氧化能力来表示。检测体液和其他样品中结合的非酶抗氧化能力可以提示总的清除活性氧自由基、抵抗氧化损伤和抗击氧化胁迫相关疾病的能力。某些情况下蛋白起作用，其他时候抗氧化需要小分子。小分子和蛋白都可以将Cu++转化成Cu+，蛋白mask可防止Cu++被蛋白还原，只分析小分子抗氧化剂的还原力。Cu+与显色探针螯合，在570nm有一个吸收峰，吸收值与抗氧化能力成正比。利用标准曲线即可计算出TCA总抗氧化能力。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）又称过氧化物歧化酶。SOD属于金属酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（CUZNSOD）、含锰超氧化物歧化酶（MN—SOD）和含铁超氧化物歧化酶（Fe—SOD）。SOD主要存在于胞液和线粒体基质中，是防御生物体氧化损伤的一种十分重要的酶。它的作用底物是超氧阴离子自由基O2-，可将其催化歧化为氧气和过氧化氢。这种酶在保护生物细胞免受超氧自由基和由其形成的活性氧类（例如H2O2,·OH）的毒害方面起着重要作用。SOD超氧化物歧化酶检测方法基于通过黄嘌呤（Xanthine）/黄嘌呤氧化酶（XOD）体系生成超氧化物阴离子。加入发色基团，发色基团可被由上述体系产生的氧化物阴离子还原成为水溶性的黄色甲染料，这样SOD活性通过抑制发生基团的还原来测定。