产品简介

rProtein A/G免疫沉淀磁珠使用“纳米表面生物技术”(S-TEC)，将rProtein A/G高密度定向包被到粒径为200 nm的纳米磁珠表面，纳米级磁珠提供的超大比表面积，具有更多的结合位点、更高的抗体结合能力和极低的蛋白非特异性吸附率，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度>90%的抗体，使用简便有效。

天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，二者功能相似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG，但在两者结合特异性上有所不同。rProtein A/G免疫磁珠同时共价偶联了蛋白A和蛋白G，比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围，实用性更高。同时，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品适用的范围广泛，可应用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等样本。

产品信息

产品性质

储存条件

2~8℃保存，有效期2年。

使用说明

工作液浓度应根据具体实验确定，建议进行预实验摸索最佳实验浓度。

1. 缓冲液配制

【注】建议以下缓冲液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

裂解缓冲液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）

平衡/结合/洗杂缓冲液：0.15 M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH7.0

交联缓冲液：0.2 M 三乙醇胺，pH8.2

中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

洗脱缓冲液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

交联剂：DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)

终止液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5

1. 抗原样品制备

本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100 µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM）。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS清洗细胞两遍；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液（裂解液应在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM）。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

大肠杆菌样品处理： 离心收集大肠杆菌（4℃, 12000g, 2 min），弃上清后称重， 按每克（湿重）菌体10 mL的比例用1×PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5-10 mL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000g, 10 min）。

1.  磁珠预处理

1. 将磁珠漩涡振荡1 min，使其充分混悬；
2. 取50 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中，放置在磁分离器上，待溶液变澄清后，用移液器吸弃保护液。
3. 加入200 µL结合缓冲液洗涤，进行磁性分离，吸弃上清，重复1次。

4.  抗体吸附

1)  加入目标抗体溶液（5-25 µg抗体总量），充分混匀，体积不足500 µL时用平衡液补足。

2)  室温孵育 10 min，可以振荡或漩涡混合均匀。

3)  将EP 管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清液。如需要可留做进一步检测。

4)  加入500 μL 洗杂液混合均匀，置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清液。重复洗杂至少 3次。 

5.  抗体交联 (备选)

1）如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行操作6。 50μL-1mL 磁珠量均可以按照以下步骤操作，无需额外增加交联液体积。

2）加入 1 mL交联液，振荡悬浮，置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次。

3）再加入1mL含有20 mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交联液， 此试剂需要现用现配。振荡悬浮，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管， 促使溶液和磁珠充分接触，约30 min后，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。

4）使用1 mL终止液悬浮磁珠，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使溶液和磁珠充分接触，约15 min后，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。

5）加入1 mL平衡液，颠倒混匀，置于磁分离器上，大约 1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。再重复两次。 

6.  抗原结合反应

1)  加入含有抗原的样品（通常100-1000 μL)，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。

2)  在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管 10 min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。

3)  上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液，以备后续检测。

4)  向离心管中加入1 mL洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，再重复洗涤两次。

 7．抗原洗脱

A. 变性洗脱 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

1) 从磁分离器上取下离心管，向其中加入25μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀， 95℃加热 5min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。

B. 非变性洗脱

1) 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入300 μL洗脱液，混合均匀，室温孵育10 min。

2) 置于磁性分离器上，进行磁性分离，收集洗脱液至新的 EP 管中。

3) 重复步骤 1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20231212