重组蛋白表达与纯化技术服务(P. Pichia表达系统)
产品名称: 重组蛋白表达与纯化技术服务(P. Pichia表达系统)
英文名称: P. Pichia表达系统
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步骤1. 目标基因全基因合成
步骤2. 目标基因亚克隆
步骤1,2详细情况可参考 基因获取及蛋白表达载体设计、构建服务
步骤3. P. Pichia表达菌株电转化:
酶切线性化表达质粒
将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中
通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆
可提供表达菌株:X33,GS115,KM71和SMD1168
提供客户:PCR阳性克隆及PCR结果报告。
时间:1周
步骤4. P. Pichia表达菌株筛选:
将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增,然后换至BMMY培养基中,并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。
如果培养上清中检测不到表达,则通过将上清浓缩20倍作用再检测,或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达(客户需要提供相关抗体)
提供客户:任意一个客户需要的阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
时间:2周
步骤5. P. Pichia表达菌株表达优化:
挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选,并对其中表达最好菌株优化表达条件。
对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目标蛋白的表达量。
提供客户:任意三个客户需要的阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。
时间:2周
步骤6. 目标蛋白表达及纯化:
摇瓶培养1L重组酵母菌,诱导表达目标蛋白。
通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
提供客户:纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90以上。
时间:2~3周
步骤7. 目标蛋白的再加工及详细检测
对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究。
内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
提供客户:加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间:1~2周
步骤8. 大规模制备
提供客户:合格的目标蛋白及服务报告。
时间:协商 ,