克隆形成实验

摘要：在A549细胞中过表达human Oct-4基因，通过对Oct-4基因过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组克隆形成数量的统计学分析，研究Oct-4对A549细胞群体依赖性和增殖能力的影响。实验结果显示Oct-4基因的表达促进A549细胞的克隆形成能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
关键词：Oct-4，克隆形成，A549

一、 实验原理
单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所形成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3 - 1.0mm之间。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强； 二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在培养皿中，持续一周以上，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

二、 实验目的
使用Oct-4-EGFP质粒瞬时转染A549细胞。通过观察Oct-4过表达的A549细胞的克隆形成率研究Oct-4基因对细胞增殖的影响。

三、 实验步骤
实验共分以下5个主要步骤：
1. 质粒转染细胞：
准备A549细胞，转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞（4μg质粒，10μl和元生物转染试剂）。
2. 制备单细胞混悬液：
转染24h后，将细胞消化，制成细胞悬液，血球计数板计数。
3. 细胞均匀接种于细胞培养平板：
铺板，6孔板每孔铺200 -1000个细胞，每组细胞各铺3个复孔。
4. 细胞培养2到3周：
每隔3天换一次新鲜培养基。
5. 观察克隆，染色，计算克隆形成率：
10~14天后，染色液染色。数码相机拍照或者扫描仪扫描，计算克隆形成率。

四、 实验结果

                                                  
                                                                     图1. 过表达Oct-4对A549细胞克隆形成的影响
     从左开始依次为A549空细胞组，对照组（过表达EGFP），实验组（过表达Oct-4-EGFP），每组实验均重复3次

                                                          图2. 过表达Oct-4对A549细胞克隆形成影响的统计分析
                                                                            **表示p<0.01;***表示p<0.001

结论：从实验结果以及克隆数的统计分析可以发现，A549细胞在过表达Oct-4-EGFP后，克隆形成能力均高于空细胞组（p<0.01）以及对照组（p<0.001）。

五、 参考文献
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