在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

标本要求：

切片、爬片

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

1、 冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷B酮固定10min，待B酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色 摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用 PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上 晃动洗涤3次，每次5min。

3、 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现 用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

4、 BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室 温封闭30min。

5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少 量水防止抗体蒸发）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属 的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

7、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育 10min。

8、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光 激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）

石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯I15-20min-二甲苯II15-20min-无水乙醇I10min-无水乙醇II10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长)。

2、 修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用 PBS 1:9稀释)覆盖 组织，37度温箱解育30min，将玻片置干PBS(PH7.4)中在脱色摇床上异动洗涤3次，每次5min

3、破膜:切片稍甩干后在圆内滴加破膜工作液要盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

4. 加试剂1.2:按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内要盖组织。切片平放干混盒内，37°C恒湿箱解音2小时，混盒内加少墨水保持温度。

5、 BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室 温封闭30min

6、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少 量水防止抗体蒸发）

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属 的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育 10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、 镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光 激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）

注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

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