细胞培养(MTT,Transwell，转染,RNAi干扰)

细胞增殖与毒性检测（MTT/CCK8）

MTT技术服务

四甲基偶氮唑盐比色法（MTT方法），是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的针状甲月替(Formazan)结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜 (DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。

目前MTT法常用于以下几个方面的研究：

1、检测细胞活性：常作为细胞毒性试验的一种方法。

2、体外药物敏感实验：该方法简便、经济、快速，重复性好，所需的细胞数较少，没有放射性，目前广泛的用于临床前的抗癌药物的筛选研究。

3、一些细胞因子活性的研究

客户方需提供:

样本描述,相关的实验设计内容如作用时间和样本浓度等。

公司方提供：

实验结果IC50值。

实验周期与费用：

实验费用以样本数和细胞株的种类数目为单位计算，实验周期为21个工作日，公司将在材料和预付的实验经费全部到位的工作日后30个工作日之内提交实验结果。客户需在收到实验结果后一周内付清所有剩余款项。

收费标准：

每个样本，1株细胞的IC50值500元。

Transwell(迁移侵袭、共培养)

转染

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：

RNAi干扰

RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。我们可对靶基因序列进行干扰位置效应评价和序列同源型分析，完成siRNA/shRNA/miRNA等多种序列的设计，并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi相关的病毒包装、RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。

※ RNAi服务类别

1、siRNA

对于瞬时基因沉默实验，化学合成siRNA的方法操作简便，容易获得高水平的瞬时沉默效果，特异性强。我们通过严格设计来增强siRNA的专一性；针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）。

1.1  普通siRNA：均由HPLC纯化，100％除去尚未配对的单链

1.2  化学修饰siRNA：利用2’-Fluoro或2’－OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通siRNA

1.3  荧光标记siRNA

2、RNAi载体

RNAi载体表达可以长时间稳定地研究基因功能，载体在细胞中持续抑制靶基因的表达可达数星期甚至更久。

miR-RNAi载体构建－利用细胞内源性的miRNA加工机制，相比传统shRNA载体可更高效地表达RNA发夹结构，并具有采用EmGFP进行表达追踪和顺式表达多个miRNA的优点。针对人类、大鼠、小鼠的大多数基因预先设计好了miRRNAi序列，每个基因设计的4条 miRRNAi Select序列我们保证至少有2条可以达到至少70%转录水平的knockdown（在转染效率>80%的前提下）。

2.2  shRNA载体构建—设计针对特定基因的shRNA序列，并将其连入组成型pENTR™/U6或诱导型pENTR™/H1/TO载体中。

3、RNAi导入优化

由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因的抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后的效率只有9%，可见如何提高siRNAs的导入效率非常重要。

3.1 RNAi转染优化－为了使得RNAi实验获得最大化的干扰效果，利用脂质体转染试剂技术，针对多种真核生物细胞进行转染参数的优化。RNAi 荧光标记的阴性对照、阳性对照可以用于进行转染效率的优化。

3.2 病毒侵染优化－针对难于转染细胞（特别是神经细胞、悬浮细胞、干细胞）和In vivo实验，基于的RNAi病毒载体构建、包装、浓缩等技术，利用腺病毒或慢病毒进行RNAi研究

3.3筛选RNAi稳定细胞株－利用抗生素来筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株

4、RNAi干扰效果检测

用实时定量PCR方法检测mRNA水平的基因敲减效果；通过Wester blot方法检测蛋白水平的基因敲减效果

※ microRNA干扰载体构建

※ 原理

miRRNAi 表达载体采用Pol II启动子表达人工设计的微小RNA (miRNA), 后者从长的转录本被加工，进而导致特异性的mRNA的降解。利用其在分子和细胞生物学以及基因调节的专有技术，为选择好的靶标设计微小RNA (miRNA)序列，并将其克隆入Pol II miRRNAi 表达载体。

※ 服务流程

1  针对特定基因，设计B Pol II miRRNAi序列；合成该序列并退火生成双链DNA；

2  将DNA与pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR载体相连，连接物转化大肠杆菌

3  测定全长序列以鉴定miRNA序列的正确性

4  制备甘油菌

5  提供数据分析和报告给客户

※ 客户提供

只需提供您研究基因的ID

※ 我们提供

构建好的Pol II miRRNAi表达载体和相应的甘油菌；赠送阴性对照甘油菌

※ 质量保证

若您购买一套克隆（针对一个基因的不同位置设计4条miRNA序列），在转染效率>80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。

※ 服务价格：询价（四个克隆和一个阴性对照）

※ 完成时间:2周(10个工作日)