DNA文库构建试剂盒(illumina)
产品名称: DNA文库构建试剂盒(illumina)
英文名称: DNA Library Construction Kit(illumina)
产品编号: HZ0200
产品价格: 0
产品产地: 中国/上海
品牌商标: 沪震生物
更新时间: 2023-08-17T10:24:20
使用范围: null
- 联系人 : 鲍丽雯
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DNA文库构建试剂盒(illumina)
中文名称:DNA文库构建试剂盒(illumina)
英文名称:DNA Library Construction Kit(illumina)
产品规格:24次|96次
本试剂盒是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的DNA文库构建试剂盒。由末端修复(End-Repair Mix)、A尾添加(A-Tailing Mix)和接头连接(Ligation Mix)三个模块构成。与同类试剂不同的是:本产品所含有的模块均为一管式包装,且经特殊工艺加工呈冻干粉状,极大增强了试剂稳定性,可在室温条件下运输,保存和实验操作,省去了体系配制,低温保藏等繁琐操作,使得操作更加简便,文库转化效率更高。
适用范围:适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
适用样本量:10ng~1μg DNA。
产品特点:
·冻干粉形式,单管酶促反应,一管完成一步反应。
·高文库转化效率,DNA样本起始量可低至10ng。
·操作简便,省去体系配制,低温保藏等步骤。
试剂盒组成:
保存条件:15~25℃保存,保质期为一年。开封未使用完的组份(末端修复、A尾添加和接头连接等试剂冻干粉)经自封铝箔袋封装后可在室温条件下保存,并在2个月内将所有组份用完。
注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项
1.操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
2.请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
3.试验开始前,请清洁操作台,并使用RNA酶及DNA酶清除试剂,如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
4.进行文库扩增前,请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
5.试验前请仔细阅读说明书,如果需要暂停试验,或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
操作流程:
使用本试剂盒以大肠杆菌DNA为例,样本DNA起始量与经qPCR定量得到的文库DNA量之间呈现良好的线性关系。
操作步骤:
一、DN**段化
本试剂盒不包含DN**段化相关试剂。对于DNA的片段化过程,客户可在超声处理、化学处理和酶处理等常用方法中选择,具体操作请参考相关产品说明。
二、末端修复
1.沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2.取出一支管盖呈蓝色的1.5ml离心管用于末端修复反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3.如有需要,可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4.按下表建立末端修复反应体系:
5.用移液器轻柔吸打6~8次混匀反应体系。
6.20℃孵育30min。
7.使用AMPure@ XP磁珠纯化末端修复产物。
8.纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9.使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10.若反应管与磁力架不兼容,可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
注:此离心管须能够容纳260μl液体。
11.每100 μl末端修复反应液中加入160 μl AMPure@ XP磁珠,吸打混匀至少5次。
12.室温放置5 min。
13.将含磁珠的反应液置磁力架上3 min,待溶液变清澈。
14.用移液器分两次吸除上清,每次128 μl。注意在吸入上清的过程中不要扰动磁珠,除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15.保持反应管置于磁力架上,向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇(注意不要扰动磁珠),室温孵育30 sec。
16.小心去除80%乙醇(~200 μl),不要扰动磁珠。
17.用80%乙醇重复洗涤一次(步骤15-16)。
18.将反应管瞬时离心后置于磁力架上,使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19.将反应管开盖置于磁力架上,室温干燥5 min
20.将反应管从磁力架上取下,加入52.5 μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水)。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21.将反应管置于磁力架上3 min,待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22.立刻进入A尾添加程序或将产物保存于-20℃ (末端补平产物可在-20℃保存7天)。
三、A尾添加
1.沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2.取出一支管盖呈黄色的1.5ml离心管用于A尾添加反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3.如有需要,可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4.向反应管内加入50 μl末端修复后的DNA纯化产物(末端修复之步骤22)。
5.用移液器轻柔吸打6~8次混匀反应体系。
6.30℃孵育30min。
7.使用AMPure@ XP磁珠纯化A尾添加产物。
8.纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9.使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10.若反应管与磁力架不兼容,可将A尾添加反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
注:此离心管须能够容纳200 μl液体。
11.每50 μl末端修复反应液中加入90 μl AMPure@ XP磁珠,吸打混匀至少5次。
12.室温放置5 min。
13.将含磁珠的反应液置磁力架上3 min,待溶液变清澈。
14.用移液器吸除上清,约135 μl。
注:吸入上清的过程中不要扰动磁珠,除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15.保持反应管置于磁力架上,向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇(注意不要扰动磁珠),室温孵育30 sec。
16.小心去除80%乙醇(~200 μl),不要扰动磁珠。
17.用80%乙醇重复洗涤一次(步骤15-16)。
18.将反应管瞬时离心后置于磁力架上,使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19.将反应管开盖置于磁力架上,室温干燥5 min。磁珠干燥期间请计算接头连接过程中所需的DNA量(X)以及接头用量(接头连接步骤中第4步)。
注:文库DNA与接头在适当的摩尔比范围内可以增加接头连接效率,进而提高文库质量和丰度。另外,使用过小体积溶液洗脱会造成DNA得率显著降低,故应使X≥20 μl。
20.将反应管从磁力架上取下,加入(X+2.5) μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水)。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21.将反应管置于磁力架上3 min,待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22.直接进入接头连接步骤或将产物保存于-20℃(添加A尾后的DNA产物可在-20℃保存7天)。
四、接头连接
1.沿锡箔纸封口袋顶部切口位置撕开试剂包装袋。
2.取出一支管盖呈紫色的1.5ml离心管用于末端修复反应。每支1.5ml离心管中所含的冻干粉试剂可供一次文库构建反应使用。
3.如有需要,可瞬时离心以确保冻干粉聚集于离心管底。
4.按下表建立接头连接反应体系:
注:本试剂盒中不含DNA接头。接头用量需根据文库DN**段用量进行调整。推荐接头产品为Single-Indexed Adapter (Illumina? Platforms)(WH0206-01/02/03)。该产品说明书中详细给出了不同情况下,DN**段与接头的最佳摩尔比,客户可进行参考。若使用其他公司的接头产品,则需参考其说明书操作。
5.用移液器轻柔吸打6~8次混匀反应体系。
6.20℃孵育15 min。
7.使用AMPure@ XP磁珠纯化末端修复产物。
8.纯化开始前将AMPure@ XP磁珠平衡至室温。
9.使用前将AMPure@ XP磁珠涡旋使其充分悬浮。
10.若反应管与磁力架不兼容,可将末端补平反应液转移至与磁力架兼容的离心管中。
注:此离心管须能够容纳200 μl液体。
11.每50 μl末端修复反应液中加入50 μlAMPure@ XP磁珠,吸打混匀至少5次。
12.室温放置5 min。
13.将含磁珠的反应液置磁力架上3 min,待溶液变清澈。
14.用移液器吸除上清,约95 μl。
注:在吸入上清的过程中不要扰动磁珠,除去上清后管底剩余少量液体不影响后续试验。
15.保持反应管置于磁力架上,向反应管管底轻柔加入200 μl 80%乙醇(注意不要扰动磁珠),室温孵育30 sec。
16.小心去除80%乙醇(~200 μl),不要扰动磁珠。
17.用80%乙醇重复洗涤一次(步骤15-16)。
18.将反应管瞬时离心后置于磁力架上,使用<20 μl量程的移液器小心去除管底残留的乙醇。
19.将反应管开盖置于磁力架上,室温干燥5 min。磁珠干燥期间请计算片段筛选过程中所需的DNA量(Z)。
注:由于不同的片段选择方法所需的上样量不同,用户可以根据后续片段筛选方法确定接头连接产物的洗脱体积(Z+2.5 μl)。其中,推荐Z的取值范围为:20≤Z≤100。如果不进行片段筛选,则推荐再次使用AMPure@ XP磁珠进行纯化以降低接头污染(50 μl接头连接产物加入50 μl磁珠,Z=50 μl)。如果不明确如何选择Z值,请参阅说明书第五部分。
20.将反应管从磁力架上取下,加入(Z+2.5) μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 8.0或者去离子水)。用移液器吸打使磁珠悬浮。
21.将反应管置于磁力架上3 min,待溶液澄清。小心吸取上清至新离心管。
22.小心吸取上清Z μl至新离心管,直接进入说明书第五部分或将产物保存于-20℃(接头连接后的DNA产物可在-20℃保存7天)。
五、片段筛选
若使用Illumina平台进行测序或进行基因组测序,文库DN**段平均大小应为400 bp(包含接头)。片段筛选步骤即旨在特异性地回收得到这部分片段,而去除过大或过小的双链及单链DN**段。以下是常用的片段筛选方法,以及使用这些方法时所需要的连接产物体积(Z)。
1.琼脂糖凝胶回收(Z=20 μl);
2.Sage Science Pippin PrepTM(Z=30 μl);
3.Life TechnologiesTM E-Gel@ SizeSelectTM Gels(Z=20 μl);
4.基于磁珠的片段筛选方法(Z=100 μl)。
注:片段筛选步骤一般在接头连接后进行,以控制文库中DN**段大小。但用户也可以根据自身需要在末端修复完成后即进行片段筛选。
六、文库扩增
本试剂盒不含PCR试剂及引物。用户需要自行选择PCR试剂,并根据文库DNA上样量确定扩增循环数。PCR结束后,可使用AMPure@ XP磁珠对产物进行纯化,并使用凝胶电泳、Qubit@、qPCR以及Angilent生物分析仪对纯化后的DNA文库进行分析。推荐试剂为NGS文库富集试剂。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!