产品内容： 
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂二：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 360μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 327μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
 
产品说明： 
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循 环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰 乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重 要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同 的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH， 在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。 NAD-MDH 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。 
需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。 
 
操作步骤： 
一、样品测定的准备： 
1、 细菌、细胞样品的制备： 
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 
2、 组织：
称取约 0.05g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置 冰上待测。 
3、 血清（浆）样品：直接检测。 
二、测定步骤和加样表： 
紫外分光光度计提前预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零，试剂一 37℃预热 15min。 
试剂名称（μL）
测定管
空白管
样本
20
 
蒸馏水
 
20
试剂一
760
760
试剂二
10
10
试剂三
10
10
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，充分吸打混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸 光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，尽量保持反应温度为 37℃。计算ΔA=A1-A2。记录ΔA 测定、 ΔA 空白。 
 
 
三、NAD-MDH 活力单位的计算： 
1、血清（浆）NAD-MDH 活力的计算 
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d）×V 反总÷V 样本÷T =6430 ×(ΔA 测定-ΔA 空白) 
2、组织中 NAD-MDH 活力的计算: 
（1）按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d）×V 反总÷(V 样本×Cpr)÷T = 6430 ×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷Cpr 
（2）按样本鲜重计算： 
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH（U/g 鲜重）=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d）×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)÷T =6430×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W 
3 细菌或培养细胞中 NAD-MDH 活力的计算: 
（1） 按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-MDH（U/mg prot）=（ΔA 测定-ΔA 空白）÷（ε×d）×V 反总÷(V 样本×Cpr)÷T = 6430×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷Cpr 
（2） 按细菌或细胞密度计算： 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 
NAD-MDH（U/10 4 cell）=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d）×V 反总÷(500×V 样本)÷T =13×(ΔA 测定-ΔA 空白) V 反总：反应总体积，0.8mL；V 样本：加入样本体积，0.02mL；
ε：NADH 摩尔消光系数， 6.22×10 -3mL/nmoL/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL； 500：细菌或细胞密度，10 4 /mL 
 
注意事项： 
1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。 
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。 
3、当初始读值小于 0.7 或者ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。 
4、建议一人加样一人比色。 
5、空白管测 1-2 管即可。