服务介绍： 免疫荧光三重标记即利用抗原抗体特异性结合原理，在同一张切片上3个抗原进行同时标记，从而实现定位，定性，半定量的分析 实验流程： 1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min-蒸馏水洗。 2 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复。喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定） 3 画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 4 血清封闭: 切片稍甩干，滴加BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭） 5 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 6 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。 7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3-TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 8 高压修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复，喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 9 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 10 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min 12 高压修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复，喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片 13 加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 14 加CY5标记的荧光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 15 DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 16 淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。 17 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 18 切片置于扫描仪下采集图像:DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光.。CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。