人AAVS1的TALENs质粒构建

摘要： 设计针对AAVS1（位于人类PPP1R12C基因的第一内含子内） 的TALENS质粒。通过固相连接等分子生物学手段，将TALENs预制模块连接到表达载体。测序结果显示，上下游TALENs质粒对构建成功，分别识别的基因组序列为：CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT。该TALENs质粒对配合Donor质粒，可以高效地将外源基因定点插入到AAVS1位点。可用于筛选定点整合稳定细胞株。
关键词：AAVS1，TALENs, 定点整合稳定细胞株

一、 实验原理
TALE 构建技术（Transcription activator–like effector engineering technology）是基于植物病原体黄单胞菌( Xanthomonas) 分泌的一种转录激活子样效应因子( transcription activator–like effector，TALE) 可以识别DNA序列的原理而设计和构建靶向特异基因的TALE蛋白的技术。TALE 蛋白是由N 端分泌信号、中央DNA结合域、核定位信号和C端激活域构成。TALE蛋白的DNA结合域是由可以识别单个核苷酸碱基的氨基酸序列模块串联而成的， 氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化组合蛋白，从而达到识别内源性基因的目的。
TALEN 技术是将TALE 蛋白中的DNA结合域与FokI 核酸内切酶的切割域融合，设计和构建能在特定基因位点产生双链断裂的的技术。双链断裂可以极大的提高断裂位点周围的基因修复活性，利用易错修复(非同源末端联结)或者同源重组修复的方式实现特异位点DNA的改造，例如定点基因敲除 (Knock-out) 、基因敲入 (Knock-in) 或点突变修饰等等。研究结果显示，人工构建的TALENs能够对动植物细胞的基因组进行高度特异的和高效的修饰。TALENs的活性和DNA序列识别的特异性在酵母、植物和哺乳动物包括人类等多种细胞中已经相继得到验证。

二、 实验目的
构建识别CCCCTCCACCCCACAGT和TTTCTGTCACCAATCCT序列的TALENs切割质粒对。

人AAVS1在基因组中的序列信息：
CCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAG

左侧识别序列长度: 17(C-CCCT-CCAC-CCCA-CAG-T)
右侧识别序列长度: 17(T-TTCT-GTCA-CCAA-TCC-T)
两个识别位点间隔15个碱基

三、 实验方法
以PCR的方法获得起始片段（识别1位碱基），用Bsa I酶切后做胶回收；从克隆库里面挑选含合适的识别位点的质粒以酶切的方法获得3~4个延伸片段（每个延伸片段一般识别4位碱基）；从克隆库里面挑选含合适的识别位点的质粒以酶切的方法获终止片段（一般识别2~3位碱基）。起始片段通过正向引物上标记的Biotin固定在磁珠上面，通过快速连接酶依次连接上延伸片段和终止片段，最后通过起始片段上的Bbs I酶切位点把全长片段从磁珠上面酶切下来。TALENs表达载体有4种，在多克隆位点下游分别还有一个分别识别A、T、G或C的序列，其中识别T序列的载体图谱如下。酶切后和以上获得的插入片段连接，得到识别特异位点的Talens质粒。

1. 起始片段的制备：
分别以预先构建的识别A、T、G或C序列的质粒为模板， 用TALENs-F1： Biotin –TCTAGAGAAGACAAGAACCTGACC和TALENs-R1   GGATCCGGTCTCTTAAGGCCGTGG进行PCR扩增。目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝电泳检测，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
2. 延伸片段和终止片段制备：
从克隆库里面挑选含合适的识别位点的质粒用限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，用水补足50μl，于37℃水浴锅孵育2小时以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
3. 全长片段的制备：
起始片段通过正向引物上标记的Biotin固定在磁珠上面，通过快速连接酶依次连接上延伸片段和终止片段，最后通过起始片段上的Bbs I酶切位点把全长片段从磁珠上面酶切下来。
4. 表达载体的线性化：
Talens表达载体有4种，在多克隆位点下游分别还有一个分别识别A、T、G或C的序列。用限制性内切酶分别对4种载体行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性酶切酶各1μl，用水补足50μl，于37℃水浴锅孵育2小时以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果， 并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 全长片段和线性化载体的连接：
                                                                                 连接反应体系
     

                     于室温25℃ 连接15min，10μl反应液转化到100μl感受态细胞中。

6. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

8. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. 起始片段的制备：
分别以预先构建的识别A、T、G或C序列的质粒为模板，用TALENs-F1： Biotin –TCTAGAGAAGACAAGAACCTGACC（引物说明：Biotin标记的正向引物，含Bbs I酶切位点）和TALENs-R1：GGATCCGGTCTCTTAAGGCCGTGG（反向引物含Bsa I-HF酶切位点）进行PCR扩增。预期PCR产物大小为137 bp，电泳结果如下：

                                             1    2 

1. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
2. PCR产物大小：137bp

2. 延伸片段和终止片段制备：
从克隆库里面挑选含合适的识别位点的质粒用限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果。酶切图谱如下图所示，其中大片段为载体片段，小片段为延伸片段或终止片段。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收延伸片段和终止片段。

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物T-SEQF：GCAGCTGCTGAAGATCGC位于克隆位点BsmB I的上游，用来菌落PCR鉴定阳性克隆和阳性克隆测序；反向引物T-SEQR：TCATTCGTTAACGCAGCCAAC位于克隆位点BsmB I的下游，用来菌落PCR鉴定阳性克隆和阳性克隆测序。阳性克隆得到约1.8kb的片段，空载体对照得到约200bp的片断。
pTALEN-AAVS1-F菌落PCR鉴定图：
                               1      2     3      4      5      6     7     8     9     10     11

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（其他阳性Talens质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11. 挑取的8个转化子，其中2号、5号、6号、8号为阳性克隆，其他为空载体或者插入的片段不是全长序列。由于插入的片段是以100bp左右为单位的重复片段，所以PCR过程容易出现弥散条带，但不影响对阳性克隆的判断。接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。

pTALEN-AAVS1-R菌落PCR鉴定图：
                             1      2       3     4      5      6    7      8      9      10   11

                        
1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（其他阳性Talens质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子，其中1号、2号5号和7号为阳性克隆，其他为空载体或者插入的片段不是全长序列。由于插入的片段是以100bp左右为单位的重复片段，所以PCR过程容易出现弥散条带，但不影响对阳性克隆的判断。接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。

4. 阳性克隆测序结果分析:
pTALEN-AAVS1-F全长CDS，其中红色字体标记的是插入片段。蓝色荧光标记的分别是上下游鉴定引物T-SEQF和T-SEQR序列，绿色荧光标记的是被BsmB I酶切开的序列。
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCACATGACGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCACATGACGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGAACATTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAACAACAACGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA

pTALEN-AAVS1-R全长CDS，其中红色字体标记的是插入片段。
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGCACTTGAGGCGCTGCTGACTGTGGCGGGTGAGCTTAGGGGGCCTCCGCTCCAGCTCGACACCGGGCAGCTGCTGAAGATCGCGAAGAGAGGGGGAGTAACAGCGGTAGAGGCAGTGCACGCCTGGCGCAATGCGCTCACCGGGGCCCCCTTGAACCTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCAAACGGAGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAATAATAACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCCAACGGTGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCATCCCACGACGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCTCCAATATTGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACCCCAGACCAGGTAGTCGCAATCGCGTCGAACATTGGGGGAAAGCAAGCCCTGGAAACCGTGCAAAGGTTGTTGCCGGTCCTTTGTCAAGACCACGGCCTTACACCGGAGCAAGTCGTGGCCATTGCAAGCAATGGGGGTGGCAAACAGGCTCTTGAGACGGTTCAGAGACTTCTCCCAGTTCTCTGTCAAGCCCACGGGCTGACTCCCGATCAAGTTGTAGCGATTGCGTCGCATGACGGAGGGAAACAAGCATTGGAGACTGTCCAACGGCTCCTTCCCGTGTTGTGTCAAGCCCACGGTTTGACGCCTGCACAAGTGGTCGCCATCGCCAGCCATGATGGCGGTAAGCAGGCGCTGGAAACAGTACAGCGCCTGCTGCCTGTACTGTGCCAGGATCATGGACTGACACCCGAACAGGTGGTCGCCATTGCTTCTAATGGGGGAGGACGGCCAGCCTTGGAGTCCATCGTAGCCCAATTGTCCAGGCCCGATCCCGCGTTGGCTGCGTTAACGAATGACCATCTGGTGGCGTTGGCATGTCTTGGTGGACGACCCGCGCTCGATGCAGTCAAAAAGGGTCTGCCTCATGCTCCCGCATTGATCAAAAGAACCAACCGGCGGATTCCCGAGAGAACTTCCCATCGAGTCGCGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAA

五、 参考文献
1. Verdier V, Triplett LR, Hummel AW, et al. Transcription activator-like (TAL) effectors targeting OsSWEET genes enhance virμlence on diverse rice (Oryza sativa) varieties when expressed individually in a TAL effector-deficient strain of Xanthomonas oryzae. New Phytol. 2012;4:1197-1207
2. Reyon D, Tsai SQ, Khayter C, et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.Nat Biotechnol. 2012;5: 460-465.