GUIDE-Pro体内脱靶检测及高通量筛选有效sgRNA

自2013年初发现CRISPR-Cas9在细胞内实现DNA精确编辑开始，该技术近年呈井喷式发展。相对于ZFN、TALEN等基因编辑技术来说，其更加简单、经济、容易操作，一般的实验室都可以构建自己的平台。令其成为迄今为止最为有效、低廉和容易的基因编辑方法。但目前CRISPR/Cas9的应用主要面临两大问题：其一是存在脱靶效应，严重影响了其临床应用；其二是sgRNA设计软件种类繁多，各有优劣。软件设计出的sgRNA需要进一步进行实验筛选，浪费了大量时间和金钱。

基于此，我们开发了一种高通量的、高敏感性和特异性的、同时检测切割效率和脱靶效应的有效sgRNA筛选方法——GUIDE-Pro。是基因编辑研究中不可或缺的脱靶检测方法，也是广大科研人员进行sgRNA筛选的利器。

脱靶检测原理及实验流程

舒桐升级版GUIDE- Pro优势

1. 直接在活细胞体内进行检测，切割效率和脱靶效应更加符合实际；
2. 更高的敏感性及特异性；
3. 更高的性价比：常用于基因编辑实验中有效sgRNA的筛选，同时获得不同sgRNA的在靶和脱靶数据，为后续实验提供有效支撑，大大降低后续实验及时间成本;
4. 更高的灵活性：除了CRISPR/Cas9，同时我们也成功开发了针对TALEN及ZFN的脱靶检测技术及分析流程；
5. 更短的服务周期：从准备细胞到最终可视化结果呈现，仅需半月。

舒桐升级版GUIDE-Pro的应用场景

1.  设计多条sgRNA后，利用GUIDE-Pro筛选切割效果最高，或者脱靶最低的sgRNA；无需再进行传统的耗时耗力的低通量筛选验证；
2.  针对前期实验已经获得的有切割能力的sgRNA，需要进一步明确其体内脱靶效应；
3. 基因编辑治疗过程中治疗效果及脱靶效应的检测。

实验示例：GUIDE-Pro VS. GUIDE-seq

1. 我们通过检测相同位点在相同数据量条件下的脱靶，结果显示：升级版GUIDE-seq的在靶reads数更高（≥1倍），脱靶reads数也提高了≥4倍。更为重要的是，GUIDE-Pro可以找到更多的脱靶位点。大大的提高了脱靶检测的敏感性和特异性。
   
2. 相较于传统GUIDE-seq，本公司研发的GUIDE-Pro技术性价比极高。常用于基因编辑实验中有效sgRNA的筛选，同时获得不同sgRNA的在靶和脱靶数据。为后续实验提供有效支撑，大大降低后续实验及时间成本。
   

3. 成功开发了TALEN及ZFN脱靶检测流程：目前全国乃至全世界均无有效的检测TALEN及ZFN基因编辑方法的检测手段，我们通过对实验及分析流程的不断改进，成功开发了针对TALEN及ZFN的检测方法。

   
   

服务内容

样品要求

1. 可提供目标基因序列，由我公司免费设计sgRNA；
2. 或由客户仅需提供sgRNA序列，由我公司构建sgRNA质粒。或者提供sgRNA质粒即可，由我公司进行转染及后续建库测序；实验用细胞系由客户提供；
3. 若提供电转后的DNA，则需要DNA样品总量：5ug以上，浓度50ng/ul以上。DNA样品纯度：OD260/280=1.8~2.0 。DNA样品完整性：DNA无明显降解，需提供凝胶电泳检测胶图。
4. 客户需检测ODN是否插入，若需我公司完成则需提供靶点信息。

参考文献

1. Ling, X. et al. Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates. Mol Cell 81, 4747-4756 e4747, doi:10.1016/j.molcel.2021.09.021 (2021).
2. Cui, Z. et al. The comparison of ZFNs, TALENs, and SpCas9 by GUIDE-seq in HPV-targeted gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids 26, 1466-1478, doi:10.1016/j.omtn.2021.08.008 (2021).
3. Fan, W. et al. Non-homologous dsODN increases the mutagenic effects of CRISPR-Cas9 to disrupt oncogene E7 in HPV positive cells. Cancer Gene Ther, doi:10.1038/s41417-021-00355-z (2021).