概述

Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina Hiseq 2500能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。通过Illumina Hiseq 2000对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的small RNA图谱，实现包括新small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、small RNAs聚类和表达谱分析等科学应用。

技术路线

生物信息学分析模块

样品要求

1）样品类型：细胞、新鲜组织或RNA样品。

2）样品量：细胞样品请提供至少1×107个细胞，组织样品请提供至少300mg的组织块或切片，RNA样品请提供10 μg以上的总RNA。

3）样品质量：RNA无明显降解，提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间，浓度≥ 500 ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。

4）样品保存：细胞样品或新鲜组织块（切成~50mg的小块）可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后，-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

5）样品运输：样品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰运输。

应用案例

通过深度测序，在9个膀胱上皮癌患者中鉴定了656个差异表达的已知人类miRNA和miRNA*（miRNA的反义序列）。与配对的正常上皮组织相比，许多miRNA和miRNA*分子在膀胱上皮癌中的表达显著上调或下调，上调的miRNA分子比下调的miRNA分子更常见。Has-miR-183，has-miR-200b～429，has-miR-200c～141和has-miR-17～92簇的表达都显著上调；而has-miR-143～145簇显著下调。在大多数的miRNA/miRNA*配对中，miRNA的表达水平比配对的miRNA*表达水平要高很多。在少数的miRNA/miRNA*配对中，miRNA比配对的miRNA*的表达要低。

参考文献

[1] Han Y, Chen J, Zhao X, Liang C et al. MicroRNA expression signatures of bladder cancer revealed by deep sequencing. PLoS One. 2011, 6(3):e18286.

[2] Wang L.W., Liu H.H, Li D.T. and Chen H.B. Identification and characterization of maize microRNAs involved in the very early stage of seed germination.BMC Genomics. 2011, 12:154.

[3] BellinghamSA, Coleman BM, Hill AF, et al.Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells.Nucl. Acids Res, 2012, doi: 10.1093/nar/gks832.