血管生成，是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新的血管，血管生成在肿瘤侵袭、伤口愈合、组织再生等多个领域都具有重要的研究价值，已经成为当前科研的热点之一。本文将从实验原理、操作细节到定量分析，帮你轻松搞定血管生成实验全流程！

一 实验原理是什么？

内皮细胞（如人脐静脉内皮细胞HUVEC）在特定基质胶上受生长因子（如VEGF）刺激后，通过迁移、增殖和连接形成管状网络结构，这一过程可直观反映血管生成的动态变化，常用于药物筛选或信号通路研究。

二 实验步骤有哪些？

1.材料准备

细胞选择：推荐原代HUVEC（传代2-8代内效果最佳）。

基质胶：使用Arcegel Matrix High Concentration, LDEV-Free基质胶，需提前24小时于4℃解冻，操作时全程冰上预冷耗材。

培养基：含5-10% FBS的内皮细胞专用培养基，添加VEGF、肝素等生长因子。

2. 基质胶铺板

基质胶稀释：将基质胶与预冷培养基按一定比例混合（可通过预实验确定，在1：1附近尝试），轻柔混匀避免出现气泡（基质胶浓度最好≥10 mg/mL，低浓度易导致成胶失败）。

铺胶技巧：将混合液垂直滴入预冷孔板（96孔板50 μL/孔，24孔板100-200 μL/孔），4℃静置10分钟使胶均匀分布，37℃孵育30分钟固化。

判断加胶量：通过观察载玻片下孔覆盖的格子纸变形情况（格子无变形为最佳）。

3. 细胞接种与观察

细胞处理：对数生长期的细胞经无血清饥饿处理16-24小时，消化后重悬至2×10⁵ cells/mL。

接种操作：每孔加入50 μL细胞悬液（约10,000个细胞），避免枪头触碰下孔胶体。若液体不足，补充无细胞培养基至满孔。静置10-15分钟，使细胞自然沉降至基质胶表面。

培养条件：37℃、5% CO₂培养箱中孵育，4-12小时内观察管状结构形成（原代细胞需更长时间）。

4.图像采集

按照细胞生长速度定时观察拍照、留存图像。可在6小时、12小时、24小时分别采集图像。

也可在荧光染色后对其进行荧光观察。

血管生成结果图

血管荧光染色图

附荧光染色步骤：移除培养基后，加入50 μL Calcein AM（96孔板，终浓度6-8 µg/mL，其他孔板依面积折算），避光孵育30分钟，PBS清洗3次后荧光成像（Ex/Em: 485/529 nm）。

三 数据分析从哪下手？

在血管生成实验中，通常通过以下参数对结果进行分析：

血管长度：总分支长度。

成环数：闭合的血管环数量。

节点数：血管交叉点数量。

覆盖面积：细胞网络占据的区域比例。

对以上数据进行测量和记录，并进行统计分析。

分析工具：推荐使用ImageJ或MetaMorph等软件进行自动化分析。

注意事项要牢记

预实验优化：不同细胞类型需调整密度，建议预实验确定最佳条件。

避免气泡：枪头预冷、垂直缓慢加样，若出现气泡可尝试4℃离心去除（300×g，10min）。

细胞活力：接种前确保细胞活率＞95%，传代次数过高的细胞成管能力显著下降。

时间控制：细胞通常在6-16 h内形成较成熟的管状结构，24 h后，细胞逐渐凋亡，小管结构破裂并与基质分离。细胞状态较差时，可能18-24h成管。建议第一次实验时，每4个小时观察一次。

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